《Chemical Research in Toxicology》：The Mechanism of Combined Exposure of Polystyrene Microplastics and Cadmium Inducing Hepatic Injury through the Modulation of PI3K/AKT/mTOR-Mediated Autophagy
引言
近年来，全球塑料消耗持续增长，年产量已达3亿吨。塑料在物理、化学、生物等因素作用下缓慢降解，形成尺寸更小的微塑料（MPs，≤5 mm）和纳米塑料（NPs，≤100 nm）。这些微纳米塑料在环境中具有持久性和低浮力特性，广泛分布于全球生态系统，可被生物摄入并通过食物链累积，造成多种不良影响。值得注意的是，微纳米塑料的生物效应呈现尺寸依赖性，不同粒径的塑料颗粒会造成不同形式的细胞损伤。例如，1–10 μm的微塑料主要诱导程序性细胞坏死，而更大尺寸（50–100 μm）的微塑料则主要诱导细胞凋亡。与200 nm和500 nm聚苯乙烯颗粒相比，20 nm聚苯乙烯颗粒在小鼠和人肝细胞系中诱导了显著的细胞毒性。相反，500 nm聚苯乙烯颗粒对肝脏和肠道组织造成的病理效应明显强于20 nm颗粒。此外，生殖毒性评估也显示了明显的尺寸-效应关系，其中100 nm聚苯乙烯造成的损伤比1 μm聚苯乙烯更显著。然而，1 μm聚苯乙烯比100 nm聚苯乙烯在小鼠中诱发了更严重的焦虑样行为和肠道损伤。这些发现表明，不同尺寸的微纳米塑料在生物体内外诱导了多样化的有害效应。在自然界中，不同尺寸的微纳米塑料共存，它们的相互作用可能增强细胞摄取效率，并诱发更严重的生物降解和生物毒性效应。早期研究已证明，同时暴露于1 μm和100 nm聚苯乙烯颗粒比暴露于单一尺寸颗粒更能增强小鼠模型的生殖毒性。虽然单独暴露于50 nm或500 nm聚苯乙烯均会损害肠道屏障功能，但联合处理被证明会诱发更严重的损伤。因此，为了更好地理解不同尺寸微纳米塑料单独及联合作用的潜在影响和毒性机制，需要更多的研究。
微纳米塑料因其疏水特性和高比表面积，对包括重金属和持久性有机污染物在内的各种有害物质具有很强的吸附能力，这引发了重大的环境关切。值得注意的是，在各种重金属中，镉是最受关注的土壤污染物之一；由于其低排泄率和高毒性，对生物健康构成严重威胁。此外，包括镉在内的有毒重金属污染物是塑料稳定剂和润滑剂中常见的成分。这促进了微纳米塑料与镉的直接接触，复杂的相互作用影响着它们在环境中的行为和生物可利用性。在先前的研究中，当聚苯乙烯与镉共孵育时，镉被聚苯乙烯吸附，导致聚苯乙烯的理化性质发生变化。因此，这种改变可能促进微纳米塑料和镉被人类和其他生物摄入。此外，不同尺寸的微纳米塑料在生物体内诱导不同的相互作用；较小的微纳米塑料更容易进入细胞，并与镉发生更直接的相互作用，从而导致不同的联合效应。
肝脏具有至关重要的代谢、合成和解毒功能，也有报道称其会累积微纳米塑料和镉。聚苯乙烯和镉通过扰乱关键肝脏酶（如丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶）的活性而引起肝毒性。作为组织损伤后的保护性反应，由聚苯乙烯和镉诱导的炎症是一种常见效应。在炎症过程中，细胞的氧化和抗氧化水平失衡，两种状态相互影响。此外，氧化应激过程中产生的活性氧可以促进自噬激活，通过吞噬氧化产物来降低氧化应激。然而，在某些情况下，过度自噬会加剧这种应激，进一步损害细胞物质和结构，甚至诱导细胞死亡。PI3K/AKT/mTOR信号通路调节许多不同的生物学过程，如自噬和细胞凋亡。至关重要的是，微纳米塑料和镉都能通过调节PI3K/AKT/mTOR信号来激活自噬。然而，目前尚无关于微纳米塑料和镉复合暴露是否能够通过PI3K/AKT/mTOR信号通路激活细胞自噬并改变氧化损伤程度，从而导致肝损伤的报道。
目前，微纳米塑料和镉的复合暴露效应仍然是一个环境关切点。在真实环境条件下，暴露于不同尺寸的聚苯乙烯颗粒（单独或与镉联合）所诱导的潜在肝毒性仍是一个积极争论的主题。本文通过研究不同尺寸聚苯乙烯颗粒和镉单独或联合暴露对昆明小鼠肝脏和正常人肝细胞的效应来探讨这些问题。此外，我们还探讨了这些暴露效应、自噬和氧化应激之间的关系，这些关系可能由PI3K/AKT/mTOR信号通路介导。
实验设计与流程
本研究使用的聚苯乙烯微球（100 nm和1 μm）购自天津某科技有限公司。聚苯乙烯颗粒分散在去离子水中，并通过超声处理5分钟以获得完全悬浮液。分析纯CdCl2溶解在去离子水中以达到所需浓度。将均匀超声分散的聚苯乙烯和镉溶液制备至所需浓度，并在室温下孵育48小时用于后续实验。
为了表征聚苯乙烯微球，将稀释的聚苯乙烯悬浮液等分试样滴加在干净的载玻片上并在室温下风干。然后将干燥的样品固定在导电碳膜上，并放置在离子溅射仪的样品台上约30秒。最后，使用扫描电子显微镜检查样品表面形态。实验细节在我们之前的研究中有所描述。
所有动物实验均严格按照中国医科大学机构动物护理和使用委员会制定的伦理标准进行。我们将64只昆明小鼠随机分为以下组别：1) 对照组（去离子水），2) 100 nm聚苯乙烯组，3) 1 μm聚苯乙烯组，4) 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯组，5) 镉组，6) 镉 + 100 nm聚苯乙烯组，7) 镉 + 1 μm聚苯乙烯组，以及8) 镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯组。在给予的微纳米塑料剂量方面，参考了Cox等人报告的人类每周摄入约5克的数据，并使用基于体表面积的剂量换算方法转换为小鼠等效剂量。基于亚急性毒性研究，选择了每天100 mg/kg体重的剂量对小鼠进行灌胃。小鼠禁食12小时后，每天以10 mL/kg体重的剂量灌胃，每周5天，持续5周。暴露后，称量小鼠体重，并采集血液进行血清分析。此外，采集肝脏组织，称重，并保存在-80 °C或用4%多聚甲醛固定。实验干预后，通过计算肝脏重量与最终体重的比率并将数值转换为百分比，得出肝脏系数值。
MIHA人正常肝细胞系购自某生物公司，常规培养于补充有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的RPMI-1640培养基中，在37 °C、5% CO2的潮湿气氛下培养。
将肝组织样品放入装有浓硝酸和过氧化氢的微波消解石英管中，并在微波消解系统中处理。酸消解后，用蒸馏水将样品定容至10 mL，然后使用电感耦合等离子体质谱法分析镉含量。
将组织标本置于增强型高光谱显微镜的样品平台上，光源强度为100%。使用60倍物镜和0.25 μs的曝光时间捕获图像。使用ENVI 4.8处理数据。选择感兴趣区域建立聚苯乙烯的光谱库，并使用空白样品的光谱库进行过滤以消除假阳性。使用光谱角制图算法实施像素级光谱匹配，以聚苯乙烯光谱库作为参考数据来识别采集图像中光谱相同的区域。应用0.1的阈值，并将像素匹配的区域标记为伪红色。
培养24小时后，通过更换完全培养基使MIHA细胞暴露于聚苯乙烯和镉。100 nm聚苯乙烯和1 μm聚苯乙烯的制备浓度如下：0, 50, 100, 200, 300, 和 400 μg/mL，镉的浓度为：0, 1, 5, 10, 20, 和 40 μM。还包括一个无细胞的空白对照组。孵育24小时后，使用CCK-8 assay结合吸光度检测来测量细胞活力。
保存在-80 °C的血清样品在4 °C下逐渐解冻，并进行离心以去除颗粒物。小心吸取澄清的上清液部分用于生化分析。使用商业诊断试剂盒量化肝转氨酶活性，包括丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶。
在pH 7.4缓冲的4%多聚甲醛溶液中固定24小时后，组织标本通过梯度乙醇系列逐步脱水。随后的处理包括使用标准方案进行石蜡渗透和包埋。通过切片机制备厚度均匀的连续切片用于组织学检查。染色前，切片依次浸入二甲苯中进行脱蜡，并在递减的乙醇梯度中复水。使用常规苏木精和伊红染色方法进行组织学评估。中性树胶封片后，在明场显微镜下观察切片。
抗原修复后，标本在冷藏条件下用LC3抗体溶液处理过夜。接下来，依次施加荧光标记的二抗和TSA染料，然后进行高温处理。在p62抗体孵育后，切片用荧光二抗和DAPI染色。最后，样品用抗荧光淬灭封片剂封片，在倒置显微镜下观察并捕获荧光信号。
为了测量，将肝组织匀浆，并裂解MIHA细胞。随后，按照试剂盒说明书测量超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽和丙二醛的水平。
为处理肝组织和MIHA细胞，向样品中加入RIPA裂解缓冲液以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂，然后进行匀浆以提取总蛋白。使用BCA蛋白测定法测量蛋白质浓度。将含有30–50 μg总蛋白的等分试样在还原条件下使用不连续SDS-PAGE分离，随后使用标准的湿转印方法电转移到PVDF膜上。膜在含有0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水中用5%脱脂乳封闭120分钟。使用以下一抗进行免疫印迹：LC3、Beclin-1、P62、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR、GAPDH和β-actin。一抗结合在4 °C下轻轻摇动进行16–18小时，随后在环境温度下与HRP标记的二抗孵育1小时。使用商业ECL试剂显影化学发光信号并进行数字捕获。使用ImageJ软件量化蛋白条带强度，并将值归一化至内参蛋白。
使用IBM SPSS Statistics分析数据，定量数据以算术平均值±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析，随后采用Fisher's LSD方法进行多重比较，采用0.05作为确定I类错误的概率阈值。使用Microsoft Excel和Prism 8.0创建可视化数据表示。
结果
聚苯乙烯微球的表征
先前扫描电子显微镜观察显示，100 nm和1 μm聚苯乙烯微球均具有均匀的尺寸和光滑的表面。然而，将100 nm聚苯乙烯与镉混合后，微球表面出现裂纹，并且观察到微球之间明显的粘连，表明镉吸附对聚苯乙烯的分散产生了负面影响。这一观察结果与Hu等人的研究一致，他们观察到聚苯乙烯与镉混合后，溶液分散度下降，粒径分布变得不均匀。因此，镉吸附改变了聚苯乙烯的性质。
不同聚苯乙烯粒径诱导小鼠肝毒性
给药期结束后，为了确定不同尺寸的聚苯乙烯颗粒是否诱导小鼠肝毒性，记录了体重和肝脏湿重，并计算了器官系数。与对照组相比，100 nm聚苯乙烯组、1 μm聚苯乙烯组和100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯组的肝脏器官系数均显著降低。然后通过增强型高光谱显微镜观察聚苯乙烯颗粒，显示它们在肝组织中积累。此外，与对照组相比，所有聚苯乙烯组的血清ALT和AST水平均显著升高。具体而言，与100 nm聚苯乙烯组相比，1 μm聚苯乙烯组表现出显著更高的血清ALT和AST水平。此外，与单一粒径聚苯乙烯组相比，100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯组显示出显著升高的血清ALT和AST水平。另外，对照组显示肝细胞排列有序，无明显脂肪变性或空泡。100 nm聚苯乙烯组和1 μm聚苯乙烯组均显示组织中有脂滴。然而，进一步比较发现，1 μm聚苯乙烯组显示肝索排列紊乱、细胞形态改变和更明显的脂滴。此外，与单一尺寸聚苯乙烯组相比，100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯组显示肝细胞排列异常和更多大小不一的空泡。因此，不同尺寸的聚苯乙烯颗粒损害了小鼠的肝组织，并且不同尺寸聚苯乙烯颗粒联合暴露显示出增强的毒性效应。
不同尺寸聚苯乙烯颗粒诱导小鼠肝脏自噬
肝组织分析显示，与对照组相比，所有聚苯乙烯暴露组的CAT和SOD活性均显著降低，同时GSH水平升高，表明显著诱导了氧化应激。与100 nm聚苯乙烯组相比，1 μm聚苯乙烯组的SOD和CAT水平显著降低，但与单一尺寸聚苯乙烯组相比，100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯组的水平变化更为显著。我们还评估了不同尺寸聚苯乙烯颗粒对肝样本中自噬的影响。免疫荧光显示，与对照组相比，所有聚苯乙烯组的LC3荧光强度均增加，而P62荧光强度降低。蛋白质印迹显示，与对照组相比，聚苯乙烯组样本中LC3II/I和Beclin-1蛋白水平升高，而P62水平降低。与100 nm聚苯乙烯组相比，这些变化在1 μm聚苯乙烯组中更为显著，并且与单一尺寸聚苯乙烯组相比，在100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯组中甚至更为明显。
与对照组相比，聚苯乙烯组肝样本中的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白水平显著降低。与100 nm聚苯乙烯组相比，这些变化在1 μm聚苯乙烯组中更为明显，并且与单一尺寸聚苯乙烯组相比，在100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯组中甚至更为显著。因此，不同尺寸的聚苯乙烯颗粒可能通过调节PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导肝细胞自噬，从而影响SOD、GSH和CAT水平，加剧肝损伤。
不同尺寸聚苯乙烯颗粒与镉联合暴露诱导小鼠肝毒性
基于不同尺寸聚苯乙烯颗粒暴露引起的肝损伤，我们进一步研究了不同尺寸聚苯乙烯颗粒与镉联合暴露对小鼠肝脏的影响。镉组和镉 + 聚苯乙烯组的肝脏系数均显著低于对照组。与对照组相比，镉组和镉 + 聚苯乙烯联合暴露组的肝镉浓度显著增加。此外，与单独镉暴露组相比，同时暴露于镉和单一尺寸聚苯乙烯颗粒的组显示肝镉含量显著降低。此外，聚苯乙烯和镉联合暴露后，聚苯乙烯颗粒在肝脏中积累。与对照组相比，镉组和镉 + 聚苯乙烯联合暴露组的血清ALT和AST水平显著升高。与镉组和镉 + 1 μm聚苯乙烯组相比，镉 + 100 nm聚苯乙烯组和镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯组显示出显著升高的血清ALT和AST水平。然而，镉 + 1 μm聚苯乙烯组和镉组之间的水平没有显著差异。在细胞形态方面，对照组肝细胞排列有序，无明显脂肪变性。在镉组和镉 + 聚苯乙烯联合暴露组中，肝细胞形状发生改变，伴有大小不一的脂滴。特别是，与暴露于单一尺寸聚苯乙烯颗粒与镉联合的组相比，镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯组显示组织中大小不一的脂滴增加。
不同尺寸聚苯乙烯颗粒与镉联合暴露诱导小鼠肝脏自噬
与对照组相比，镉暴露和镉 + 聚苯乙烯暴露显著降低了肝脏CAT和SOD活性，但增加了GSH水平。此外，与暴露于单一尺寸聚苯乙烯颗粒与镉联合的组相比，镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯组显示SOD和CAT水平显著降低。
免疫荧光测定显示，与对照组相比，镉暴露组和镉 + 聚苯乙烯组的LC3荧光强度显著增加，而P62荧光强度降低。蛋白质印迹显示，与对照组相比，镉和聚苯乙烯联合暴露组的LC3II/LC3I和Beclin-1蛋白水平升高，同时P62水平降低。与镉 + 1 μm聚苯乙烯组和镉组相比，这些变化在镉 + 100 nm聚苯乙烯组中更为明显。此外，与单独镉组或镉与单一尺寸聚苯乙烯颗粒联合暴露组相比，镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯组在蛋白表达水平上表现出更显著的变化。此外，与对照组相比，镉暴露组和镉 + 聚苯乙烯组的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白表达比率显著降低。与镉组和单一尺寸聚苯乙烯颗粒与镉联合暴露组相比，这些降低在镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯组中更为明显。此外，与镉 + 1 μm聚苯乙烯组和单独镉组相比，镉 + 100 nm聚苯乙烯组的p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR比率显著降低。因此，不同尺寸的聚苯乙烯颗粒与镉联合暴露可能通过调节PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导肝细胞自噬，从而影响SOD、GSH和CAT水平，加剧肝损伤。
不同尺寸聚苯乙烯颗粒与镉联合暴露对MIHA细胞活力的影响
使用CCK-8 assay评估了100 nm聚苯乙烯、1 μm聚苯乙烯、镉单独或联合暴露24小时后对MIHA细胞活力的影响。当100 nm聚苯乙烯组浓度为100 μg/mL且镉浓度为10 μM时，MIHA细胞活力下降至约80%。因此，选择100 μg/mL的100 nm聚苯乙烯、100 μg/mL的1 μm聚苯乙烯和10 μM镉用于后续测定。与聚苯乙烯或镉单独暴露相比，镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯暴露显著降低了MIHA细胞活力。
聚苯乙烯与镉联合暴露可能通过自噬加剧氧化损伤
向细胞补充自噬抑制剂3-MA后，与对照细胞相比，镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯处理显著上调了LC3II/I比率，同时下调了P62蛋白水平。在3-MA处理组中，LC3II/I比率显著降低，而P62蛋白表达显著增加。与镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯组相比，镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯 + 3-MA组的LC3II/I和P62水平分别显著降低和升高。接下来，与对照细胞相比，镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯细胞显示出显著降低的SOD和GSH水平以及显著升高的MDA水平。此外，与镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯细胞相比，镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯 + 3-MA细胞显示出显著升高的SOD和GSH水平以及显著降低的MDA水平。因此，聚苯乙烯与镉联合暴露似乎诱导了小鼠肝脏的过度自噬，从而加剧了氧化应激。
PI3K/AKT/mTOR信号通路在暴露于聚苯乙烯与镉联合的MIHA细胞中诱导自噬和氧化应激的作用
与对照细胞相比，镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯处理显著降低了p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR水平。然而，补充PI3K激活剂740Y-P逆转了这种抑制。相反，在740Y-P处理的细胞中，记录到p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白水平显著增加。与单独用镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯处理的细胞相比，在镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯处理的细胞中添加740Y-P显著提高了p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白比率。与对照细胞相比，镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯细胞显示出显著增加和降低的LC3II/I和P62蛋白水平。在740Y-P细胞中，记录到LC3II/I蛋白水平显著降低，P62蛋白水平显著增加。与镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯细胞相比，镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯 + 740Y-P细胞分别表现出LC3II/I蛋白水平的显著降低和P62蛋白水平的显著增加。此外，与对照组相比，暴露于镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯诱导了SOD和GSH水平的显著降低，同时伴随着MDA水平的升高。与单独暴露于镉 + 100 nm聚苯乙烯 + 1 μm聚苯乙烯的细胞相比，同时用740Y-P处理的细胞显示出显著上调的SOD和GSH水平，同时伴随着MDA水平的显著下降。这些观察结果进一步证实，聚苯乙烯与镉联合暴露通过PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导肝细胞自噬，从而调节SOD、GSH和MDA水平，增加肝脏氧化应激，并加剧肝损伤。
讨论
微纳米塑料在全球广泛分布，经常被生物摄入并通过食物链积累。然而，由于检测技术有限，研究仅在人体的较大尺寸微塑料中进行了检测和观察。在动物模型中，50 nm和500 nm聚苯乙烯颗粒均被证明会在脾脏、肾脏、心脏、肝脏、肺和血液中积累。在我们的研究中，高光谱成像技术证明100 nm和1 μm聚苯乙烯颗粒在小鼠肝组织中积累。基于这些发现，我们检查了血清中的肝功能标志物，并观察到暴露于100 nm和1 μm聚苯乙烯颗粒会显著升高ALT和AST水平，表明肝功能受损。此外，苏木精-伊红染色显示，暴露于100 nm和1 μm聚苯乙烯颗粒会引起形态学改变，并伴有大小不一的脂滴。这些观察结果表明，100 nm和1 μm聚苯乙烯颗粒单独或联合均对肝脏造成病理损伤。这些发现与Mu等人的研究一致，他们表明5 μm聚苯乙烯颗粒会影响小鼠的肝功能并诱导病理损伤。此外，通过评估氧化应激相关标志物，暴露于100 nm和1 μm聚苯乙烯颗粒显著改变了SOD、GSH和CAT水平，导致肝组织氧化损伤。我们的结果进一步表明，暴露于100 nm和1 μm聚苯乙烯颗粒会诱导小鼠肝损伤，而100 nm和1 μm聚苯乙烯联合暴露显示出最明显的毒性。我们的结果证实了Liang等人的发现，他们证明与单独暴露于任一尺寸相比，同时暴露于500 nm和50 nm聚苯乙烯会诱发更严重的肠道毒性。当两种不同尺寸的微纳米塑料联合时观察到的增强毒性效应可能归因于较大的颗粒可能促进较小纳米颗粒的细胞摄取，导致细胞内部颗粒总量增加。同时，混合可以改变它们的理化性质，从而影响其毒性。引人注目的是，与100 nm聚苯乙烯相比，1 μm聚苯乙烯诱导的肝毒性更为严重。这一发现得到了Huang等人的证实，他们观察到在小鼠中，200 nm和500 nm聚苯乙烯颗粒比20 nm聚苯乙烯颗粒诱导了更强的肝脏和肠道毒性。虽然预期较小的颗粒会表现出更强的效应，但较大聚苯乙烯颗粒的更严重效应可能是由于内化水平的差异。当颗粒尺寸处于特定的内化范围内时，较小的颗粒往往比较大的颗粒更有效地被内化。较大颗粒的存在，由于内化较少，会导致它们在器官中积累，从而加剧肠道损伤和肠道通透性的增加，并诱发更严重的毒性。此外，穿过肠道单层细胞后，微纳米塑料颗粒可能会改变其理化性质，可能导致其他细胞摄取机制，例如通过内吞作用进入肝细胞，这可能会改变其对肝细胞的毒性效应。未来需要深入的验证研究来验证这些假设。
考虑到实际暴露场景的多面性，微纳米塑料作为载体，将镉吸附并带入生物体。因此，我们检查了肝组织中的镉积累，结果显示在镉组以及镉和聚苯乙烯联合暴露组中均有积累。然而，与单独镉组相比，镉和聚苯乙烯联合暴露组的肝镉含量降低。这一发现与Wen等人和Zou等人的研究一致，他们提出聚苯乙烯和聚氯乙烯微塑料减少了组织中镉的积累。Lu等人也报道了5 μm聚苯乙烯颗粒增加了斑马鱼肝脏中镉的积累。因此，聚苯乙烯颗粒联合暴露引起的肝毒性并不总是增强重金属的生物可利用性。这可能与微塑料的化学性质、金属类型和浓度以及环境因素有关。从我们对血清肝脏指标的分析来看，镉组以及镉和聚苯乙烯联合暴露组的ALT和AST水平显著升高，表明肝功能异常。从苏木精-伊红染色来看，聚苯乙烯和镉联合暴露改变了肝细胞形状，并诱导了含有脂肪滴的大小不一的空泡。因此，这种联合作用对小鼠肝组织造成了病理损伤。此外，在镉组以及镉和聚苯乙烯联合暴露组中均发现了SOD、GSH和CAT的显著变化，表明存在氧化损伤。这些结果表明，镉暴露，或与100 nm聚苯乙烯或1 μm聚苯乙烯联合，会诱导小鼠肝损伤。此外，100 nm聚苯乙烯颗粒显著增强了镉诱导的肝毒性效应，这与Sun等人的研究一致，他们表明5 μm聚苯乙烯颗粒显著增强了镉诱导的肝损伤。然而，与此结果相比，我们对1 μm聚苯乙烯和镉联合暴露的分析并未显示小鼠镉肝毒性效应增加，组间无显著毒性差异，这与Wang等人的研究相反。然而，最近Sheng等人报道，与镉暴露相比，1 μm聚苯乙烯和镉联合暴露诱导的肝毒性没有显示出任何显著差异，这与我们的发现一致。此外，我们表明，100 nm聚苯乙烯、1 μm聚苯乙烯和镉的联合暴露显示出最显著的肝毒性效应。研究差异可能不仅与微纳米塑料的粒径有关，也可能与微纳米塑料和镉的暴露浓度有关。因此，未来的研究需要探索促进或抑制镉毒性的微纳米塑料和镉的临界浓度范围。
自噬是一个动态过程，受到细胞营养可用性和代谢平衡的严格调控。在应激条件下，自噬通常被认为是一种保护机制，可以减轻损伤。在饥饿条件下，自噬降解细胞成分以提供额外的能量和营养物质，确保细胞存活。在缺氧条件下，自噬消除受损的细胞成分，促进细胞存活，并通过调节氧化应激来减轻损伤。然而，在某些情况下，过度自噬会加剧氧化应激，进一步损害细胞物质和结构，甚至诱导细胞死亡。我们的数据表明，聚苯乙烯和镉单独或联合暴露显著增加了小鼠肝脏中的LC3II/I和Beclin-1蛋白水平，同时降低了P62水平。同时，暴露破坏了抗氧化酶平衡，增加了GSH水平，降低了SOD和CAT水平。因此，聚苯乙烯和镉单独或联合暴露可能诱导了小鼠肝脏的过度自噬，加剧了氧化应激。这些结果证实了Zou等人的发现，即微塑料通过氧化应激和自噬增强了镉诱导的肾毒性。为了进一步证明聚苯乙烯和镉联合暴露对自噬的影响，我们在向MIHA细胞添加自噬抑制剂3-MA后检查了LC3和P62蛋白水平。我们观察到，3-MA在聚苯乙烯和镉联合暴露后显著降低了LC3II/I蛋白水平，但增加了P62蛋白水平，增强了SOD和GSH水平，并降低了MDA活性。这一结果与Wu等人在术后焦虑模型中的发现一致，其中补充3-MA被证明可以增加SOD活性，同时降低GSH活性。这些观察结果进一步证实，聚苯乙烯和镉联合暴露过度激活了自噬，加剧了肝脏的氧化损伤。
PI3K/AKT/mTOR信号通路在不同细胞类型的自噬中具有关键的调节作用。PI3K主要调节炎症和免疫功能，激活下游信号分子AKT，进而激活mTOR以抑制自噬。在聚苯乙烯和镉单独或联合暴露后，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白水平显著降低。这表明
