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这篇综述性研究论文系统地评估了红外（IR）光活化在可溶性多蛋白复合物（MPCs）的天然自上而下质谱（nTD MS）与复合物自上而下质谱（CxD MS）分析中的应用价值。研究通过对比红外多光子解离（IRMPD）、活化离子电子转移解离（AI-ETD）与高能碰撞解离（HCD）三种离子活化技术，揭示了IR光活化在提升蛋白质序列覆盖度、揭示复合物结构信息方面的互补性与潜力，为深入解析蛋白质复合物的结构与功能提供了新的技术视角和实验依据。
引言：蛋白质复合物分析的质谱技术前沿
生物功能的实现依赖于蛋白质的特定形式——蛋白形式（proteoforms）及其形成的多蛋白复合物（Multiproteoform Complexes, MPCs）。为了揭示MPCs的组成、结构并将其与生物功能相关联，质谱技术扮演着核心角色。其中，天然自上而下质谱（native Top-Down Mass Spectrometry, nTD MS）和复合物自上而下质谱（complex-Down Mass Spectrometry, CxD MS）已成为强大的分析策略。nTD MS直接对完整复合物进行活化与测序，能够保留其高阶结构信息；而CxD MS则通过温和活化先释放出单体亚基，再对单体进行测序，避免了异质复合物产生的混合谱图问题。然而，这两种方法的测序覆盖度在很大程度上受限于所使用的离子活化技术。因此，拓展活化策略是提升蛋白质复合物表征能力的关键。
红外光活化：一种多功能的MPCs分析工具
本研究首次在配备CO2激光器的改装Orbitrap Ascend Tribrid质谱仪上，系统评估了红外（IR）光活化用于可溶性MPCs的nTD MS与CxD MS分析的潜力。研究选用了三种标准MPCs：乙醇脱氢酶（ADH，147 kDa四聚体）、烯醇化酶（96 kDa二聚体）和丙酮酸激酶（PK，232 kDa四聚体）。红外光子被用于诱导红外多光子解离（IRMPD）以及通过活化离子电子转移解离（Activated-Ion ETD, AI-ETD）来增强基于电子的碎裂，并将其性能与高能碰撞解离（Higher-Energy Collisional Dissociation, HCD）进行了基准比较。
研究发现，IR活化不仅可用于解离，还能有效促进可溶性蛋白质组装体的去溶剂化和去簇合，相比传统的源内碰撞诱导解离（sCID），能获得更准确的质量信息。此外，IR驱动的解离能够释放单体亚基，其产生的电荷状态分布与sCID和HCD相似。
HCD与IRMPD单体碎裂的异同
研究将HCD作为参考离子解离方法。对于所有研究的MPCs，无论是在CxD MS还是nTD MS实验中，HCD在序列覆盖度方面均优于IRMPD。一个反直觉的现象是，nTD MS实验中获得的亚基序列覆盖度高于CxD MS实验，这可能是由于释放出的亚基前体离子信号强度较低所致。
尽管HCD和IRMPD在产生的骨架切割位点（如脯氨酸N端侧、天冬氨酸和谷氨酸C端侧）上显示出相似的倾向性，但产物离子丰度（Product Ion Abundance, PIA）分析揭示了二者的独特特征。HCD产生的序列标签中，连续碎片离子丰度水平相似。而IRMPD则表现出更强烈的倾向，集中在更少的热点位置进行切割，产生数量较少但信号强度很高的碎片，其余位置的骨架切割强度则非常低。这种高度可预测的骨架切割倾向，可能在基于分离时间尺度的天然自上而下MS应用中具有优势。
AI-ETD的碎片模式与IRMPD及HCD形成互补
作为第二种由IR启用的离子解离方法，AI-ETD在CxD MS和nTD MS场景下均进行了测试。在ADH的分析中，无论是解离完整的四聚体还是释放出的单体，AI-ETD的性能都优于ETD和EThcD。在nTD MS中，AI-ETD的测序效率可与HCD相媲美。
更重要的是，AI-ETD在产生的骨架切割位点方面与HCD和IRMPD存在显著的互补性。对于亚基质量较大的PK（约57 kDa），AI-ETD的优势尤为明显，其获得的序列覆盖度（nTD MS为27.8%）大约是HCD或IRMPD的两倍。这表明对于大型蛋白质亚基，AI-ETD能提供更广泛的序列信息。此外，AI-ETD在解离ADH四聚体时，产生了最多仍携带Zn(II)离子的N端碎片。
nTD MS中的测序模式提供了原始MPC的结构信息
nTD MS和CxD MS在结构层次上探测MPCs的方式不同，因此应能提供互补的序列信息。nTD MS活化完整的组装体，可以保留裂解时四级结构的要素，从而反映天然复合物中的溶剂可及性和界面保护情况。而CxD MS通过中间的喷射步骤扰动亚基界面，可能促进单体的部分去折叠。
对ADH的PIA图分析证实了这一点。使用HCD和IRMPD时，nTD MS强调了与MPC溶剂可及区域一致的序列区域，而CxD MS则增加了对原本在天然组装中被屏蔽的中心和C端区域的访问。这表明振动活化尽管会促进复合物去折叠，但仍能保留四级结构信息。
对于AI-ETD，nTD MS模式产生了延伸到N110残基的大量c型离子系列，而CxD AI-ETD的谱图则主要由b/y型离子主导。这表明在CxD MS分析中，ADH的有效碎片化主要源于IR驱动的振动活化，而非基于电子的骨架切割。尽管如此，CxD MS仍然提供了nTD MS难以访问的中心区域的序列信息，这与单体释放后的部分去折叠现象一致。
整合策略最大化序列覆盖度
研究证明，整合多种正交的碎片化策略可以显著提高序列覆盖度。将本研究中测试的三种活化方法（AI-ETD、HCD和IRMPD）在nTD MS实验中的结果相结合，ADH、烯醇化酶和PK的序列覆盖度分别达到48.3%、43.2%和32.7%。若进一步结合CxD MS的结果，覆盖度可提升至55.8%（ADH）、45.1%（烯醇化酶）和46.5%（PK）。覆盖度的提升幅度取决于每种MPC的四级结构。烯醇化酶的提升幅度较小，与其在天然复合物中两端均溶剂可及的特性一致。相反，PK的覆盖度提升显著（约14%），这与其晶体结构中N端和C端都参与亚基界面相互作用的情况相符。
尽管CxD MS理论上应通过暴露被埋藏区域来促进更深入的测序，但实验结果显示其绝对序列覆盖度并未高于nTD MS，只是探查了多肽链中未被nTD MS探索的区域。这表明单体释放伴随着结构重排，而非简单的均匀去折叠。不对称电荷分配事件可能产生仅部分去折叠的单体离子，其新形成的静电相互作用选择性地限制了多肽链的部分区域，从而调控了碎片化行为。
结论与展望
本工作证明了Tribrid Orbitrap平台用于天然自上而下质谱的潜力，以及增加红外激光如何显著扩展未来研究MPCs可用的工具集。红外光活化可作为结构生物学工具（即nTD MS）使用，或通过在大规模研究中探查未知的MPCs来补充变性自上而下MS实验（即CxD MS）。低能红外光子的使用改善了MPC的去溶剂化、亚基喷射和亚基测序。
具体而言，IRMPD可有效用于旨在表征通过液相色谱或毛细管电泳分离的MPC混合物的非靶向实验。而AI-ETD在实现大型MPC亚基的广泛序列覆盖方面显示出更大潜力。未来的研究需要进一步评估HCD和IRMPD在碎片化倾向性上的基本差异，并从机理上解释所观察到的差异（特别是关于AI-ETD碎片化中作为MPC一部分的亚基与喷射后的亚基在b/y型离子与c/z型离子相对丰度上的不同）。此外，纳入紫外光解离（UVPD）可能通过访问更高能量的碎片化途径，在序列覆盖度以及配体或界面结合区域的分析方面提供互补的见解。
