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本研究利用低溫基質隔離技術，結合窄帶/寬帶近紅外激發，首次實驗揭示了非經典核鹼基異鳥嘌呤（isoG）在惰性氣體基質中的兩種OH旋轉異構體，並成功實現了其選擇性光控構象轉換。研究發現，高能構象可通過氫原子隧穿效應自發轉變為最穩定構象，並精確測定了其在氬（Ar）與氖（Ne）基質中的時間常數。該工作為理解生物相關雜環分子的氫原子隧穿過程及環境調控的互變異構現象提供了關鍵實驗見解。
文章內容歸納
引言
異鳥嘌呤（isoG），也稱2-氧代腺嘌呤或2-羥基腺嘌呤，是一種具有重要生物學和化學意義的非經典嘌呤核鹼基。它可在DNA中作為腺嘌呤氧化應激的產物出現，其存在與誘變事件相關。isoG能與DNA中的異胞嘧啶（isoC）形成穩定性可與經典鳥嘌呤-胞嘧啶對相媲美的沃森-克里克鹼基對。此外，isoG表現出多樣的鹼基配對行為，不僅能與胞嘧啶配對，還能與胸腺嘧啶、鳥嘌呤和腺嘌呤配對，這可能導致轉換和顛換突變。這些特性被認為是儘管isoG在結構上與經典核鹼基相似，卻未被生物系統採用的根本原因。
除了其生物學相關性，isoG在合成遺傳學領域也重新引起了關注。早在1962年，isoG–isoC對就被提出作為擴展遺傳字母表的第三個鹼基對。最近，isoG已被納入八字母擴展遺傳密碼的「hachimoji」DNA和RNA系統中。這些應用進一步強調了在分子水平上理解異鳥嘌呤固有結構和動力學特性的重要性。
isoG的一個顯著特徵是其顯著的互變異構現象和構象靈活性，這受到環境的強烈調控。在非極性環境中，isoG的烯醇形式被預測比酮式互變異構體更穩定，而在生理條件下，甚至在DNA螺旋內，isoG以氨基-烯醇、氨基-氧代和亞氨基-氧代形式的混合物存在。多種互變異構體和構構象的共存為isoG的異常鹼基配對行為提供了分子基礎。使用高水平的理論方法，Blas等人證明isoG是展示環境控制互變異構現象的一個突出例子。根據該理論研究，在生理條件下相關的互變異構體僅佔isoG氣相種群的不到0.001%。這種對環境的強烈敏感性凸顯了在低溫惰性氣體基質這種明確條件下研究孤立isoG單體的重要性。
儘管已有大量關於isoG及其互變異構體在氣相中光物理行為的研究，但對於孤立異鳥嘌呤單體的構象相互轉換、構象特異性光化學控制或自發氫原子隧穿過程，此前尚無實驗研究。基質隔離光譜學提供了一個獨特的機會來解決這些問題，它能夠在低溫條件下穩定並選擇性地通過光誘導轉換單個分子構構象。然而，在本研究之前，從氣相捕獲在惰性基質中的isoG的構象圖景尚未得到實驗表徵。仍然未知的是，isoG構構象之間的相互轉換是否可由光控制，或者這種構象轉變是否可以通過量子力學隧穿自發發生。
方法
實驗部分
本研究中使用的異鳥嘌呤為商業產品。將異鳥嘌呤固體樣品置於固定在低溫恆溫器罩內的玻璃微型爐中。從該電阻加熱爐中出來的異鳥嘌呤蒸氣與過量的氬、氖或氮基質氣體一起沉積在冷的CsI窗口上。使用氬、氖和分子氮作為基質氣體。使用傅立葉變換紅外光譜儀收集基質隔離分子的紅外和近紅外吸收光譜。為記錄光譜，光譜儀配備了相應的光源、分束器和探測器。在某些實驗中，在基質樣品和光譜儀光源之間放置了一個長通紅外濾光片。使用連續波可調諧二極體雷射發出的窄帶近紅外光對基質隔離分子進行照射。雷射光束的波數使用波長計測量。寬帶近紅外和紅外照射通過使基質樣品暴露於傅立葉變換紅外光譜儀光源的光下來進行。
計算部分
所有計算均使用Gaussian 16程序套件進行。在DFT(B3LYP)/6–311++G(3df,3pd)理論水平上優化了異鳥嘌呤異構體的結構。在優化的幾何結構處，在同一理論水平計算了諧振頻率和紅外強度。為了近似校正振動非諧性、基組截斷和忽略的電子相關部分，對高於3000 cm–1的理論波數使用了縮放因子。通過將計算的波數與實驗波數進行最小二乘線性擬合，獲得了低於3000 cm–1波數的縮放因子。對在DFT(B3LYP)/6–31++G(d,p)水平計算的isoG理論簡正模進行了勢能分佈分析。為了表徵分隔isoG氨基-羥基N(9)H互變異構體的兩個構構象的能壘，對兩個OH旋轉異構體之間的過渡態幾何結構進行了完全優化。計算諧振頻率以驗證所找到平穩點的Hessian矩陣有一個虛頻。隨後，從優化的過渡態開始，在兩個方向上繪製了內稟反應坐標，直到在每一側檢測到局部極小值。在DFT(B3LYP)/6–311++G(3df,3pd)和MP2/6–311++G(2d,p)理論水平計算了構象轉換的能壘。能壘高度計算為過渡態能量與高能構構象能量之間的差值。
結果
異鳥嘌呤最穩定的異構形式及其紅外光譜
根據之前發表的計算，氨基-羥基N(9)H互變異構體是該化合物能量最低的形式。該互變異構體的能量預測比異鳥嘌呤任何其他形式的能量低30 kJ mol–1以上。因此，可以合理地預期，只有該氨基-羥基N(9)H互變異構體的兩個OH旋轉異構體I和II應在氣相中佔據並被捕獲在低溫基質中。在本工作中使用MP2/6–311++G(2d,p)和DFT(B3LYP)/6–311++G(3df,3pd)方法計算了形式I和II的相對能量。在這些水平上，預測形式I的能量比形式II低0.75 kJ mol–1(MP2)和0.62 kJ mol–1(DFT)。
在本研究中，異鳥嘌呤單體被捕獲在低溫氬、氖和氮基質中。光譜中1700–900 cm–1區域存在的紅外譜帶表明，氨基-羥基N(9)H構構象I和II都是從氣相捕獲的。在1506、1396、1385、1347、1195和986 cm–1(Ar)處的譜帶及其在1509、1398、1385、1346、1200和985 cm–1(Ne)處的對應譜帶可歸屬於最穩定的形式I，而在1496、1489、1416、1373、1199和1103 cm–1(Ar)處的譜帶及其在1497、1490、1415、1375、1203和1105 cm–1(Ne)處的對應譜帶可歸屬於較高能量的構構象II。在沉積不同基質後立即記錄的光譜（使用相同的惰性基質氣體）中，歸屬於形式I的譜帶相對於歸屬於形式II的譜帶的相對強度彼此不同。這表明在沉積過程結束時，捕獲在不同基質中的形式I和II的比例不同。可能的原因可能與基質沉積時間的不同（此時自發過程可能部分消耗形式II並增加形式I的數量）或暴露已沉積分子於光譜儀紅外光束引起的構象變化有關。
光譜的較高波數3650–3400 cm–1區域可以很容易地解釋。在3495/3491 cm–1(Ar)處的分裂譜帶可歸屬於N(9)H基團的伸縮振動。在3493 cm–1(Ar)處觀察到的嘧啶的νN(9)H譜帶，以及在3499/3489 cm–1(Ar)處觀察到的腺嘌呤的譜帶有助於對觀察到的基質隔離異鳥嘌呤實驗譜帶的指認。在3568/3560和3450/3444 cm–1(Ar)處發現的分裂譜帶可分別歸屬於NH2基團的反對稱和對稱伸縮振動。在異鳥嘌呤孤立於氬基質的光譜中，由於νN(9)H、νaNH2和νsNH2振動引起的譜帶明顯分裂為兩個主要成分。這種分裂不能作為兩種不同形式的異鳥嘌呤被捕獲在基質中的證據。觀察到的νN(9)H、νaNH2和νsNH2吸收譜帶的形狀是由於眾所周知的基質位點分裂效應引起的，該效應是由分子被限制在不同微環境（基質位點）中引起的。對於被捕獲在氖基質中的異鳥嘌呤單體，位點分裂效應明顯較弱。在3606和3599 cm–1(Ar)處觀察到的譜帶應分別歸屬於異鳥嘌呤氨基-羥基N(9)H互變異構體的構構象II和I的OH基團的伸縮振動。對於這些譜帶，位點分裂效應比由於νN(9)H、νaNH2和νsNH2振動引起的譜帶小得多。將3599 cm–1(Ar)處的譜帶歸屬於形式I，將3606 cm–1(Ar)處的譜帶歸屬於構構象II，得到了自發或近紅外誘導的這些形式相互轉化效應的強力支持。
氬和氖基質中孤立異鳥嘌呤單體近紅外誘導的構象轉換
對於孤立在氬或氖基質中的異鳥嘌呤單體，還在近紅外範圍收集了光譜，預計在此範圍會出現由於倍頻和合頻振動引起的吸收譜帶。最強的吸收發現於7070.7 cm–1(Ne)和7027 cm–1(Ar)處，可歸屬於氨基-羥基N(9)H構構象I的OH基團伸縮振動的倍頻。用調諧在7027 cm–1的二極體雷射窄帶光照射氬基質，導致異鳥嘌呤從構構象I轉換為構構象II。當含有異鳥嘌呤單體的氬基質在6844或6853.7 cm–1處被照射時，也獲得了類似的效應。對圖3中所示差譜的更詳細分析表明，在7027 cm–1或6853.7 cm–1處激發，誘導了被捕獲在氬基質兩個主要位點中的異鳥嘌呤分子的構象轉變，而在6844 cm–1處激發僅誘導了被捕獲在其中一個位點中的分子的構象轉變。相反方向II → I的構象轉換是通過用窄帶近紅外6847或6856.3 cm–1光激發孤立在氬基質中的異鳥嘌呤分子誘導的。在6847 cm–1處激發誘導了被捕獲在氬基質兩個主要位點中的分子的構象轉變，而在6856.3 cm–1處激發幾乎只誘導了其中一個氬基質位點中的構象轉變。
類似的近紅外誘導構象轉換也在孤立於氖基質中的異鳥嘌呤分子中觀察到：I → II轉換發生在窄帶照射於6864.9或7070.7 cm–1時，而II → I轉換發生在照射於6867.9、6884.1或6887.4 cm–1時。值得注意的是，異鳥嘌呤的兩個OH旋轉異構形式之間的異構化不僅可以通過激發OH伸縮倍頻來實現，還可以通過激發遠端NH或NH2基團的伸縮倍頻來實現。觀察到的過程證明了分子內振動弛豫的存在，該弛豫將沉積在遠端NH伸縮坐標中的能量帶入反應性的OH扭轉模式。
光誘導構象轉變不僅在激發窄帶近紅外雷射光時發生在基質隔離的異鳥嘌呤單體中，而且在分子暴露於來自傅立葉變換紅外光譜儀光源的寬帶輻射時也發生。在一個專門的實驗中研究了寬帶照射氬基質中捕獲的異鳥嘌呤分子的效應。在一次實驗運行中，用窄帶7027 cm–1近紅外光照射基質隔離的異鳥嘌呤單體。通過這種照射，產生了高數量的異鳥嘌呤構構象II。隨後，基質一直保持低溫，並持續暴露於來自光譜儀光源的寬帶輻射。通過週期性記錄中紅外範圍的光譜來監測這種照射引起的變化進展。在第二次實驗運行中，基質最初在黑暗中保持了一段時間。這導致了構構象I的高數量，這是由於自發的II → I隧穿轉換。隨後，樣品保持暴露於來自光譜儀光源的寬帶光下，並週期性監測這種照射引起的過程進展。在兩次實驗運行中，長時間暴露於寬帶紅外和近紅外光導致了幾乎完全相同的最終構構象比例。無論構構象I和II的初始比例如何，長時間照射光譜儀光源的光都導致了相同的異鳥嘌呤構構象比例（59.9%的分子採用結構I，40.1%的分子採用結構II）。顯然，在寬帶紅外和近紅外光照射下，I → II和II → I兩個方向都發生了光誘導轉變。光誘導構象轉換在兩個方向上同時發生，導致了最終的光穩態。
氬和氖基質中孤立異鳥嘌呤單體的自發構象轉換
異鳥嘌呤的較高能量構構象II可以通過氫原子隧穿自發轉變為最穩定的形式I。為了觀察這一過程，首先將孤立在氬基質中的化合物單體暴露於7027 cm–1的單色近紅外輻射。暴露於這種輻射會誘導基質隔離分子發生I → II轉換。經過一小時的近紅外照射後，基質中形式II的數量顯著增加。然後，將基質在低溫和黑暗中保持多個小時。通過週期性記錄2100–600 cm–1範圍內的光譜來監測發生在基質隔離分子中的自發轉換進展。在光譜儀光源和基質樣品之間放置了一個長通濾光片。該濾光片保護基質免受波數高於2222 cm–1的光譜儀光的影響。這樣的濾光片防止了所研究的兩種OH形式在異構化能壘之上的激發。
對孤立於氖基質中的異鳥嘌呤單體也進行了類似的實驗。在這種情況下，通過用窄帶6864.9 cm–1光照射孤立的異鳥嘌呤單體來製備含有增強數量構構象II的基質。對於氬和氖基質，將孤立分子在黑暗中保持較長時間（數小時的週期性監測進展，加上過夜的17小時（氬）或12小時（氖））導致較高能量形式II幾乎完全被消耗。相應地，最穩定的構構象I的數量顯著增長。
實驗差譜與為構構象I和II理論預測的光譜的比較，毫無疑問地表明，在氫原子隧穿過程中被消耗的較高能量形式是構構象II，而異鳥嘌呤最穩定的形式是氨基-羥基N(9)H形式I。在基質隔離化合物保持低溫和黑暗期間，週期性監測歸屬於異鳥嘌呤形式I和II的紅外譜帶強度。基於這些測量，繪製了譜帶強度隨時間的演變圖。從圖的斜率可以確定II → I隧穿轉換的時間常數。
如圖9所示，對於孤立在氖基質中的異鳥嘌呤單體，隧穿構象轉換發生得稍快（τ = 2.0 h），而對於孤立在氬基質中的單體則較慢（τ = 4.1 h）。對自發OH旋轉異構化過程進展的詳細分析表明，該過程的速度不僅取決於基質宿主材料，還取決於單體化合物被限制的微環境（基質位點）。
氮基質中孤立異鳥嘌呤單體的近紅外輻射誘導轉換和缺乏自發隧穿構象轉換
異鳥嘌呤單體也沉積在固體氮基質中。為了避免在基質沉積過程中誘導構象轉變，通過放置長通濾光片來監測沉積進展。沉積完成後記錄的最終光譜也使用相同的濾光片收集。沉積後，將基質保持低溫2小時。在此階段結束時，在2100–400 cm–1區域拍攝了基質隔離異鳥嘌呤單體的光譜（使用長通濾光片）。在2小時後記錄的光譜與基質沉積後立即記錄的光譜相同。這表明暴露於波數低於2222 cm–1的光不會誘導孤立異鳥嘌呤分子的任何構象變化。在2小時的觀察中，未觀察到任何表明基質隔離異鳥嘌呤單體中自發OH旋轉異構化的強度變化。固體氮環境對自發OH旋轉異構化的類似影響在其他化合物中也觀察到過。
還記錄了孤立在氮基質中的異鳥嘌呤在近紅外範圍的光譜。在該光譜中觀察到的吸收譜帶位置允許我們選擇用於照射基質的近紅外光的波數。暴露氮基質於窄帶7036 cm–1光導致了I → II構象轉變，而在7009 cm–1處照射基質誘導了II → I構象變化。假設近紅外誘導轉換將構構象I和II相互轉換而沒有損失，則可以基於反映這種轉變的差譜來確定歸屬於形式I和II的一對選定紅外譜帶的絕對強度之比。這使得我們能夠根據氮基質沉積後立即記錄的光譜中的譜帶強度來評估構構象I和II的數量比。異鳥嘌呤構構象在氮基質中被凍結，沒有發生任何構象變化。通過這種方式，我們評估了形成基質的氣相中數量比[I]/[II] = 1.3。
結論性討論
當前工作中的實驗表明，異鳥嘌呤在氣相中僅採用氨基-羥基N(9)H互變異構形式。這種互變異構形式的兩個構構象（OH旋轉異構體）從氣相被捕獲在低溫氬、氖和氮基質中。研究表明，這兩個OH旋轉異構體可以在用特定波長的窄帶近紅外雷射光激發時選擇性地相互轉換。研究還表明，暴露基質隔離的異鳥嘌呤單體於寬帶近紅外和紅外光會誘導兩個方向的構象轉換。由於這些光誘導轉換的結果，在長時間用寬帶近紅外和紅外光照射異鳥嘌呤單體時，建立了光平衡（光穩態）。
當含有異鳥嘌呤兩種OH旋轉異構體的氬或氖基質在黑暗和低溫下保持時，一個單向的自發過程將較高能量的構構象轉換為較低能量的形式。這種自發轉換導致較高能量形式的完全消耗及其轉變為異鳥嘌呤最穩定的結構。可以預期，這種完全轉變是單向氫原子隧穿過程的結果。
觀察到的基質隔離異鳥嘌呤OH旋轉異構體的自發構象轉換時間常數（τ = 4.1 h，氬）顯著低於在胞嘧啶OH旋轉異構體中觀察到的自發構象變化時間常數（τ = 36.5 h，氬）。氫原子隧穿過程速度的這種顯著差異可能與這些結構相似化合物中OH內旋轉的能壘有關。在苯酚中，OH旋轉非常快，該過程的能壘相當低。在2-羥基嘧啶中，OH旋轉的能壘要高得多。如此高能壘的原因是OH基團的氫原子與環氮原子的孤電子對相互作用。這種相互作用穩定了相對於過渡態的平面結構，在過渡態中氫原子採用垂直於環的位置。對於胞嘧啶的穩定性較差的OH旋轉異構體，類似的穩定相互作用受到氨基團的影響，氨基團充當環N(3)原子孤電子對密度的競爭者。
OH伸縮振動的頻率是上述相互作用的良好度量。在苯酚中，這種穩定相互作用完全不存在，由於OH伸縮振動引起的譜帶在3634 cm–1處觀察到。在胞嘧啶中，類似的譜帶在顯著較低的波數3601 cm–1處發現，而在2-羥基嘧啶中甚至更低，在3591 cm–1處。這一實驗觀察與計算的胞嘧啶中OH旋轉異構化能壘值在37.1 kJ mol–1(DFT)或35.0 kJ mol–1(MP2)相一致，該值低於2-羥基嘧啶中的能壘。在異鳥嘌呤的構構象II中，與環氮原子孤電子對的相互作用受到N(9)H基團存在的影響。由於存在與位於N(1)氮原子的孤電子對密度的競爭者，νOH譜帶的頻率（3606 cm–1，氬）高於胞嘧啶中的頻率。理論計算的異鳥嘌呤中OH旋轉的能壘，35.8 kJ mol–1(DFT)或33.5 kJ mol–1(MP2)，低於胞嘧啶中OH旋轉的能壘。非常引人注目的是，胞嘧啶和異鳥嘌呤中OH旋轉異構化能壘高度這種看似微小的差異，導致了兩種化合物隧穿構象轉變時間常數接近一個數量級的差異。
來自N(9)H基團的氫原子的存在，它是環氮原子孤電子對密度的比氨基團更強的競爭者，使得構構象II的能量高於構構象I的能量。換句話說，在異鳥嘌呤中，OH基團指向氨基團的構構象比另一個OH旋轉異構體更穩定。在胞嘧啶中，其中孤對電子密度的唯一競爭者是氨基團，OH基團指向氨基團的構構象的能量高於另一個最穩定形式的能量，在後者中，OH基團的氫可以在沒有任何競爭者的情況下與環上另一個氮原子的孤電子對相互作用。
