钙离子结合型PLGA微球释放rhBMP-2：增强脊柱融合骨愈合并显著减少异位骨形成

《Biomaterials Science》：Calcium-binding PLGA microparticles releasing rhBMP-2 for enhancement of bone healing with minimal ectopic bone formation in spine fusion

这篇研究开发了一种新型递送系统——钙离子结合聚合物PBMP涂层的PLGA微球，用于负载重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）。该系统通过增强微球在骨表面的亲和力，实现了rhBMP-2在脊柱融合手术部位的局部缓释，显著促进骨再生，同时将异位骨形成率从>60%降至≤10%，为临床安全高效的骨修复提供了创新策略。

　　

引言

骨诱导与骨传导功能对于损伤后的骨形成、重塑及愈合至关重要。然而，老年患者中成骨细胞数量减少、活性减弱，常导致骨愈合延迟或不愈合。自体骨移植虽是金标准，但仍需骨替代材料以增强骨形成。骨形态发生蛋白（BMPs），尤其是BMP-2和BMP-7，是强效的成骨因子，但其临床应用受限于半衰期短、快速清除及副作用。高剂量BMP-2治疗虽可克服药代动力学缺陷，却易引发因蛋白扩散至非靶组织导致的过度骨形成等不良反应。

为应对这些挑战，多种生物材料被开发用于调控BMP-2的时空释放，以最小化副作用并增强骨再生。其中，聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）作为FDA批准的可生物降解聚合物，因其良好的生物相容性和可调控的药物释放动力学，被广泛用于骨再生领域。然而，传统递送系统对骨缺损部位的亲和力不足，易导致BMP-2过早扩散，降低再生疗效并引发异位骨形成。

本研究团队此前开发了一种对钙基表面具有强结合亲和力的药物递送系统，通过用聚（甲基丙烯酸丁酯-共-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸酯）（PBMP）涂层PLGA微球，利用PBMP中的磷酸单酯侧链赋予其强大的钙结合能力。本研究将该系统应用于蛋白药物rhBMP-2的局部递送，以增强脊柱融合手术中的骨愈合。

材料与方法

研究合成了PBMP聚合物，并通过水/油/水（w/o/w）双乳液法制备了负载rhBMP-2的PLGA微球（BMP-2-PLGA）及PBMP涂层微球（BMP-2-PLGA/PBMP）。对微球的形貌、粒径、Zeta电位、蛋白负载量及释放动力学进行了表征。通过碱性磷酸酶（ALP）活性检测评估了释放的rhBMP-2的生物活性。使用荧光素负载微球测定了微球与大鼠股骨ex vivo的结合亲和力。通过RT-qPCR和免疫细胞化学分析了MC3T3-E1前成骨细胞中成骨标志物（RUNX2、ALP）的表达。

在大鼠自体髂骨（AIB）脊柱融合模型中，评估了不同处理组（对照组、游离rhBMP-2组、三种剂量BMP-2-PLGA/PBMP组）在术后4周和8周的骨形成情况。通过微CT扫描量化骨体积变化，并统计异位骨形成的发生率。组织学切片经阿利新蓝和马松三色染色，观察新骨与软骨形成。

结果与讨论

成功合成了BMA与MOEP比例为60:40的PBMP聚合物（M_n= 16.9 kDa，M_w= 32.2 kDa）。制备的BMP-2-PLGA和BMP-2-PLGA/PBMP微球呈球形，平均粒径约0.7 μm。PBMP涂层使微球Zeta电位显著降低（从-8.14 mV降至-27.18 mV），证实了成功涂层。两组微球的rhBMP-2负载量（~0.6 μg mg^-1）和包封效率（~25%）无显著差异。

蛋白释放实验表明，BSA模型蛋白和rhBMP-2均从微球中持续释放超过8周，初始突释约20%，随后缓慢释放。PBMP涂层对释放动力学无显著影响。ALP活性检测证实，从BMP-2-PLGA/PBMP释放的rhBMP-2其成骨诱导活性与游离rhBMP-2相当，表明包封过程未损害蛋白生物活性。

Ex vivo骨结合实验显示，PLGA/PBMP微球在大鼠股骨表面的荧光信号强度是未涂层PLGA微球的约2倍，证明PBMP涂层显著增强了微球对钙质骨表面的亲和力。

体外成骨诱导实验显示，与BMP-2-PLGA相比，BMP-2-PLGA/PBMP处理能显著上调MC3T3-E1细胞中Runx2基因表达（2.3倍），并诱导更高的RUNX2和ALP蛋白表达。这表明增强的骨表面亲和力有助于维持局部较高的rhBMP-2浓度，从而更有效地促进成骨分化。

在大鼠脊柱融合模型中，微CT分析显示：游离rhBMP-2组（5 μg）在术后0-4周内骨体积急剧增加（+126 mm³），但在4-8周内无显著变化。相反，BMP-2-PLGA/PBMP组（2.5 μg和5 μg剂量）在0-4周骨体积变化不大，但在4-8周骨体积显著增加（+56 mm³和+63 mm³），体现了缓释系统的优势。低剂量组（0.5 μg）效果不显著，表明存在剂量依赖性。组织学染色进一步证实，BMP(2.5)-PLGA/PBMP组在术后8周仍能观察到显著的新骨和软骨形成信号。

关于副作用，异位骨形成评估结果令人瞩目：术后4周，游离rhBMP-2组异位骨形成发生率高达7/9（>60%），而所有BMP-2-PLGA/PBMP组发生率极低（0/5至1/10）。术后8周趋势保持一致，游离rhBMP-2组发生率为6/10，而PLGA/PBMP各组仍保持极低水平（0/5至1/10）。这强有力地证明，PBMP涂层通过将微球锚定在手术部位，有效防止了rhBMP-2扩散至非靶区，从而几乎消除了异位骨形成这一关键临床副作用。

结论

本研究成功开发了PBMP涂层的PLGA微球递送系统，用于rhBMP-2的局部缓释。该系统通过增强对骨表面的结合亲和力，实现了rhBMP-2在脊柱融合部位的靶向递送与长效释放。动物实验证明，该系统不仅能促进持续有效的骨再生（长达8周），更能将异位骨形成这一严重副作用的发生率从超过60%大幅降低至10%以下。该策略为克服BMP-2临床应用的局限性、实现安全高效的骨修复提供了极具潜力的解决方案。未来研究可在扩大动物样本量的基础上，探索共包封其他生长因子或抗炎药物的协同治疗策略。