《Advanced NanoBiomed Research》：Beyond PEGylation: Archaeal Lipids for Long-Circulating Liposomes
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本文是一篇研究论文，探讨了聚乙二醇（PEG）在药物递送中面临的免疫原性挑战，并首次在体内验证了古菌脂质，特别是卡德古菌醇（GDGT），作为PEG的潜在替代物在延长药物循环时间方面的有效性。研究以万古霉素为模型药物，通过药代动力学和生物分布成像等方法，对比了基于古菌脂质提取物（ALE）、纯化GDGT及传统PEG化脂质体的性能，发现GDGT脂质体可达到与PEG化脂质体相当的延长循环效果，并可能减少肾毒性风险，为开发更安全、长效的纳米药物递送平台提供了新思路。
超越聚乙二醇化：古菌脂质用于实现长循环脂质体
引言
聚乙二醇（PEG）化是目前延长治疗药物在体内循环时间、提高其稳定性和疗效的最有效策略之一。这种长链聚合物通过提供“隐形”效果，避免调理素化和巨噬细胞清除，从而显著影响活性药物成分（API）的药代动力学。然而，反复治疗或环境暴露于PEG化成分可能诱导抗PEG抗体的产生，这引发了对PEG免疫原性的日益关注，并促使人们寻找具有类似性质但免疫原性较低的替代材料。迄今为止，多糖和多醇等已作为潜在的PEG替代品受到关注。近期的综述文章提出，古菌脂质可能在非肠道应用中为延长血液循环带来希望。古菌脂质天然存在于古菌域成员的细胞膜中，拥有醚键而非传统脂肪酸基脂质中的酯键。其主要包括跨单层的四醚脂质（TELs）和形成双层的二醚脂质（DELs）。在非肠道给药途径中，TELs的应用前景尤为广阔，显示出在血清中具有优异的胶体稳定性以及与高密度脂蛋白（HDL）的相互作用最小化等特点。
古菌脂质作为佐剂已有较多研究，其不仅能增强脂质纳米载体的结构稳定性，还能诱导强烈的体液和细胞介导免疫反应。然而，除了作为佐剂外，古菌脂质在非肠道药物递送方面的研究极少，大多数研究仅限于体外观察。仅有一篇体内非肠道研究文献报道了使用合成TEL进行pDNA递送，但该合成TEL与天然存在的TELs有根本性不同。
在本研究中，我们以广泛用于对抗革兰氏阳性菌感染的糖肽类抗生素——万古霉素为模型药物，研究了古菌脂质对其药代动力学的影响。我们考察了包含古菌脂质提取物（ALE）以及TEL卡德古菌醇（GDGT）的载药纳米载体在大鼠体内的药理特性，并与PEG化纳米载体进行了比较。
结果
2.1 脂质体制剂的理化表征
所有脂质体制剂（ALE、GDGT和PEG脂质体）的粒径均在约107–119纳米范围内，具有低多分散指数（PDI < 0.2），表明其为单分散分布。ALE和GDGT脂质体显示轻微负的Zeta电位，而PEG脂质体几乎呈电中性。所有脂质体制剂的包封率（EE%）和载药量（DL%）相当，EE%在62%至78%之间，DL%在4.9%至6.2%之间。
2.2 脂质体在血浆和磷酸盐缓冲盐水中的稳定性
在37°C下，将ALE、GDGT和PEG脂质体在大鼠血浆或磷酸盐缓冲盐水（PBS）中孵育长达8小时。在所有制剂和孵育条件下，包封的万古霉素含量均接近初始值，在t0时测得值的91%至108%之间。在整个孵育期间，未观察到包封万古霉素出现时间依赖性的减少。相应的粒径和PDI测量结果也证实了脂质体在两种条件下的稳定性。
2.3 静脉给药后万古霉素的血浆浓度
与游离万古霉素相比，给药后5分钟测得的峰血浆浓度分别增加了2倍（ALE脂质体）、3.6倍（GDGT脂质体）和8.7倍（PEG脂质体）。游离万古霉素表现出快速的血浆清除，而使用脂质体制剂则显著延长了万古霉素的全身循环时间。注射后8小时，脂质体治疗组中万古霉素的血浆浓度仍高于或与游离万古霉素在1小时观察到的水平相当，这表明了其具有缓释行为。
2.4 万古霉素血浆滴度的非房室分析
反映总体药物暴露量的曲线下面积（AUC）显示，与游离万古霉素相比，ALE脂质体增加了7.3倍，GDGT脂质体增加了9.2倍，PEG脂质体增加了24.4倍。此外，所有脂质体制剂都观察到消除速率常数降低和半衰期延长，表明药代动力学特征得到改善。
2.5 群体药代动力学建模
成功拟合了一个包含个体间变异性和制剂特异性效应的两房室群体药代动力学模型。估计了每种脂质体制剂相对于游离万古霉素对万古霉素清除率（Cl）和中央室分布容积（Vc）的影响。所有制剂都显著降低了清除率，但Cl和Vc降低的程度各不相同。为了评估两个参数的共同影响，模型显示GDGT和PEG脂质体的影响非常显著，而ALE的影响则估计不太显著。配对比较显示，GDGT和PEG脂质体之间无统计学显著差异，表明效果程度相似。然而，PEG和ALE脂质体之间存在显著差异，而GDGT和ALE脂质体之间的比较则未达到显著性。
2.6 白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α的释放
通过分析白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）评估了促炎反应。对于ALE和GDGT脂质体，在所研究的所有时间点，这两种细胞因子均低于检测限。
2.7 游离和脂质体万古霉素的闪烁成像和生物分布
使用碘-125（125I）放射性标记的万古霉素进行闪烁成像，评估了万古霉素（无论是游离还是包封在脂质体中）的生物分布。与游离万古霉素相比，包封在脂质体制剂中的万古霉素表现出不同的行为，包括延长血液循环和改变器官分布。特别是，通过GDGT脂质体递送的万古霉素主要在肝脏中积累，而通过PEG化脂质体递送的万古霉素则主要通过肾脏清除。
讨论
为了应对PEG化制剂的免疫原性挑战，开发替代材料已成为药物递送研究的重点。我们的研究结果表明，含有GDGT的脂质体显著提高了万古霉素的全身暴露量并延长了循环时间，其药代动力学特征与PEG化制剂相当。而含有更复杂脂质提取物ALE的脂质体也延长了万古霉素半衰期并降低了相对于游离药物的清除率，但程度较低。
与游离万古霉素相比，使用脂质体制剂显著延长了万古霉素的全身循环时间。据我们所知，这项研究首次提供了体内证据，表明古菌脂质，特别是GDGT，可以在非肠道药物递送应用中有效降低清除率。而在PEG化系统中，所谓的“隐形”效应源于聚合物层施加的空间位阻，这最大限度地减少了蛋白质吸附并降低了免疫细胞的识别。相比之下，基于古菌脂质的纳米载体延长的循环时间可能源于不同的机制。本研究中观察到的有利药代动力学特征可能反映了古菌脂质脂质体赋予的优异胶体和膜稳定性，这与聚集、融合和酶降解的减少有关。
所有脂质体制剂均表现出相当的理化特性和药物掺入参数。包封效率、载药量、PDI和粒径均在一定范围内，并且在磷酸盐缓冲盐水和大鼠血浆中孵育期间保持稳定。此外，在8小时内未观察到与制剂相关的万古霉素泄漏增加。总之，这些结果表明，血浆万古霉素浓度的差异不太可能源于不同的包封效率、载药量或脂质体不稳定性，而是反映了体内制剂特异性行为。
生物分布成像定性地表明，游离万古霉素在10分钟后即出现强烈的肾脏清除，而脂质体制剂似乎延长了活性药物成分的全身循环。当使用PEG脂质体作为递送载体时，肾脏区域显示出明显的放射性标记万古霉素信号，而GDGT脂质体则引起了相对更强的肝脏定位。这些观察结果表明，含有PEG和古菌脂质的纳米载体可能遵循不同的摄取和清除途径。当使用GDGT脂质体时，万古霉素在肝脏中的积累可能表明GDGT脂质体促进了单核吞噬系统介导的肝脏摄取，而在使用PEG脂质体时，万古霉素主要通过肾脏清除。GDGT脂质体观察到的肾脏信号减少，对于减轻万古霉素相关的肾毒性可能是有益的。
有趣的是，虽然ALE脂质体在体内也显著降低了万古霉素的清除率，但其对药代动力学参数的整体影响不如GDGT或PEG脂质体显著。这种效应可能与ALE的异质组成有关，ALE包含带有各种极性头基的二醚脂质和四醚脂质。二醚组分的存在（它们形成双层而非单层膜结构）可能会降低所得脂质体的稳定性或隐形特性。此外，ALE脂质中存在的碳水化合物头基可能改变蛋白质冠的形成方式，从而影响巨噬细胞的识别。
为了评估潜在的免疫原性效应，我们还测定了细胞因子IL-6和TNF-α的释放。虽然早期关于古菌脂质脂质体的研究报告了其佐剂特性，但在本研究测试的条件下未观察到显著的细胞因子诱导。这些差异可能归因于脂质组成、剂量和免疫读数时间的变化。报告的佐剂效应主要涉及来自其他古菌物种（主要是产甲烷菌和嗜盐生物）脂质的纳米载体，这些物种在膜结构和头基化学上与嗜酸硫化叶菌有显著差异。
尽管PEG化因其对药代动力学的有益影响而被广泛用于药物递送，但它也会影响药物制剂在储存期间的理化稳定性。类似地，双极性醚脂质也被报道可以改善制剂在长期储存期间的稳定性，并减轻储存期间的颗粒融合事件。
结论
本研究提供了初步证据，表明古菌脂质，特别是GDGT，可能作为非肠道药物递送中有效的PEG替代剂。通过显著改善万古霉素的药代动力学，含有古菌脂质的脂质体为基于PEG的系统提供了一个有前景的替代方案，可能在未来的纳米医学应用中提供更好的生物相容性和更低的免疫原性。
实验部分
实验部分详细介绍了研究所用的材料与方法。古菌脂质提取物（ALE）和卡德古菌醇（GDGT）由NovoArc GmbH提供。脂质体通过双离心法制备，使用卵磷脂（EPC）、胆固醇和5 mol%的ALE或GDGT或DSPE-PEG(2000)以85:10:5的摩尔比构成。通过动态光散射测定粒径和Zeta电位，通过高效液相色谱法测定万古霉素浓度并计算包封率和载药量。血浆稳定性研究将脂质体在37°C的大鼠血浆或磷酸盐缓冲盐水中孵育长达8小时。动物药代动力学实验在雄性Wistar大鼠中进行，通过尾静脉注射给予万古霉素，并在8小时内采集血样。使用液相色谱-质谱联用技术测定万古霉素血浆水平。通过酶联免疫吸附测定法测定白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α的释放以评估促炎反应。使用基于先前开发的两房室模型的群体药代动力学建模来评估制剂效应。万古霉素使用碘-125进行放射性标记，并制备含有放射性标记万古霉素的脂质体。通过γ相机对麻醉大鼠进行闪烁成像，以评估放射性标记万古霉素的生物分布。
