PKG驱动Chromochloris zofingiensis的代谢适应和盐胁迫响应机制

《Journal of Biotechnology》：PKG Drives Metabolic Adaptation and Salt Stress Response Mechanisms in Chromochloris zofingiensis

盐胁迫通过渗透压、离子毒性和氧化应激影响作物和微藻生长，微藻因其高效光合作用和代谢多样性成为资源匮乏和环境污染的解决方案。研究证实硝基氧化（NO）-cGMP-蛋白激酶G（PKG）信号通路在真核生物中调控离子稳态和抗氧化防御，但其在微藻中的功能尚未明确。通过比较盐胁迫下Chromochloris zofingiensis野生型与PKG缺陷突变体（Cz-pkg）的生长、色素代谢、脂积累及转录组差异，发现PKG缺失显著降低盐耐受性，完全抑制astaxanthin积累，并抑制脂质合成。转录组分析显示PKG调控MEP途径、类胡萝卜素代谢及脂肪酸合成相关基因，增强抗氧化防御和代谢向astaxanthin及脂质分配。该研究首次揭示PKG在微藻盐胁迫适应中的核心作用，为培育耐盐藻株和改良作物提供新依据。

　　

袁媛媛|郭宇坦|杨书芳|郑洁|李志雄|王浩|叶颖|刘瑾|黄俊超|孙涵

南昌大学生命科学学院，中国南昌，330000

摘要

盐胁迫通过渗透压应激、离子毒性和氧化应激影响作物和微藻的生长。微藻凭借其高效的光合作用和多样的代谢方式，为资源短缺和环境挑战提供了有前景的解决方案。一氧化氮（NO）-cGMP-蛋白激酶G（PKG）信号通路是真核生物中调节离子平衡和抗氧化防御的保守应激反应途径。尽管研究表明PKG可以通过GAMYB转录因子在植物中调节应激适应，但其在微藻中的作用尚不清楚。为了阐明PKG在盐胁迫适应中的作用，本研究聚焦于一种cGMP依赖性蛋白激酶G（PKG）被失活的Chromochloris zofingiensis突变株（Cz-pkg），并将其与野生型株（Chromochloris zofingiensis野生型，Cz-WT）进行比较，分析了它们在不同盐浓度下的生长、色素代谢、脂质积累和基因表达的差异。研究发现，PKG的失活显著降低了盐耐受性，并导致虾青素积累完全丧失，同时显著抑制了脂质生物合成。转录组分析进一步表明，PKG调节参与MEP途径、类胡萝卜素代谢和脂肪酸合成的关键基因，特别是增强了抗氧化防御和向虾青素及脂质生产的碳流。这些结果表明，PKG通过协调抗氧化反应和代谢重编程，在微藻对盐胁迫的适应中起核心调节作用。本研究首次提供了PKG在微藻盐耐受性中的作用的证据，为培育抗逆株和耐盐作物提供了见解。

引言

全球人口的增长和资源短缺挑战了粮食安全。传统农业对土地和淡水的依赖是不可持续的，尤其是在淡水短缺的情况下，这使得盐胁迫成为限制农业生产与生态系统的一个关键因素（Wang, Li等人，2023）。高盐度会破坏光合作用、养分吸收和代谢，威胁粮食安全（Zhang, Cai等人，2024）。微藻具有高效的光合作用、快速生长和多样的代谢产物，为粮食和能源问题提供了解决方案（Yu, Pyo等人，2024）。此外，微藻对废水和海水的耐受性显示了其在污染控制和高效资源利用方面的双重潜力（Tan, Low等人，2024）。然而，在高盐度环境中最大化其资源潜力受到盐胁迫的限制。这种胁迫不仅抑制生物量生长，还作为环境信号，显著影响高价值化合物（如脂质和蛋白质）的代谢效率和积累（Shetty, Gitau等人，2019）。

盐胁迫对微藻的生长和代谢产生多方面的影响，影响其表现和代谢产出，因此其具体机制（因条件而异）是研究的重点。高盐度通常通过降低细胞分裂率和生物量积累来抑制微藻生长。研究表明，在低至中等盐度条件（10–25‰）下，微藻Phaeodactylum tricornutum和Spirulina platensis可以通过代谢调节维持一定的生长活力并表现出盐适应性。然而，当盐度进一步升高超过30‰时，这种适应反应迅速受到破坏。在高盐度胁迫（≥30‰）下，这两种微藻的细胞增殖率显著减缓，细胞周期进程受阻，最终表现为干生物量和细胞密度的显著下降（Uzlasir, Selli等人，2023）。同样，盐胁迫在Chlamydomonas reinhardtii中引发了一系列表型变化，包括细胞体积减小、增殖减缓，在高NaCl浓度下甚至出现鞭毛吸收（Zhang, Xing等人，2022）。此外，盐胁迫还抑制了Golenkinia sp的生物量积累并诱导细胞增大。尽管这些抑制效应在去除胁迫后可以逆转（Ma, Jiang等人，2024）。这些生理损伤伴随着光合能力的下降，这与应激引起的能量限制一致。盐胁迫经常刺激次级代谢产物的积累，尤其是类胡萝卜素和脂质。在0.17 M NaCl盐胁迫下，Haematococcus pluvialis的生长速率显著降低，而其虾青素含量增加（Gao, Meng等人，2014）；而在高盐度下，Tisochrysis lutea产生的岩藻黄质含量高达79.40 mg/g（Mohamadnia, Tavakoli等人，2021）。脂质代谢也受到强烈影响：盐度可以通过增加饱和脂肪酸和调节生物合成途径来改变脂肪酸谱（Venkata Mohan和Devi，2014；Wang等人，2016）。上调与脂质合成相关的基因（如PDH2、ACCase、MAT、KAS2）在盐胁迫下进一步促进脂质积累（Atikij等人，2019；Zhao等人，2022）。此外，将盐度与其他环境因素（如强光或异养）结合可以协同放大代谢产物的产生，例如在C. zofingiensis中，高光和盐胁迫结合条件下虾青素增加了7.53倍（Kou, Liu等人，2020），以及在葡萄糖补充条件下脂质和类胡萝卜素的共同积累（Sun等人，2008；Mao等人，2018）。

盐胁迫通过诱导NO、ROS和Ca2?等信号分子来调节微藻的基因表达和代谢（Hasanuzzaman等人，2018；Szymańska等人，2019）。NO激活可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）将GTP转化为cGMP，进而激活cGMP依赖性蛋白激酶（PKG）（Bassot, Chauvin等人，2019）。在哺乳动物中，NO-cGMP-PKG通路调节离子平衡和渗透压平衡（Green, Stratton等人，2007），但其在植物中的作用仍需进一步研究（Nan, Wang等人，2014；Marondedze, Groen等人，2016）。研究表明PKG在植物中调节非生物胁迫反应，例如调控水稻中的GAMYB转录因子，影响种子萌发、节间伸长和花粉活力（Shen, Zhan等人，2019）。然而，PKG在微藻中的作用尚未研究。盐胁迫破坏微藻的离子平衡和渗透压平衡，引发氧化应激。作为NO-cGMP通路的核心调节因子，PKG可能在胁迫期间协调离子平衡、基因表达和代谢途径。例如，NO激活抗氧化系统，缓解氧化应激，恢复光合作用，并调节盐胁迫下的基因表达（Siddiqui等人，2010；Wang等人，2017）。NO-cGMP级联反应还与赤霉素诱导的α-淀粉酶产生、种子萌发和光形态发生有关（Wu, Wang等人，2012）。ROS是另一种关键的信号分子，与Ca2?合作调节生长和代谢产物合成（Wheeler和Brownlee，2008），尽管过量的ROS会导致脂质过氧化、蛋白质损伤和细胞死亡（Arif, Singh等人，2020）。迄今为止，尚无直接的生化或遗传学证据证明PKG在微藻中的活性或其生理功能。目前对PKG的理解主要来自高等植物，其中NO-cGMP-PKG通路调节离子平衡、氧化平衡和应激适应。因此，研究盐胁迫下的PKG可以揭示NO-cGMP-PKG通路在植物和微藻中的作用，为提高盐耐受性和促进次级代谢产物的积累提供新的见解。整合基因组学、转录组学和代谢组学来分析盐胁迫下的PKG靶点和调控网络将加深对其功能的理解。

本研究利用C. zofingiensis突变株Cz-pkg来研究PKG在盐胁迫响应和葡萄糖感知中的作用及其相关的代谢途径，从而了解微藻在盐碱条件下的适应机制。为此，我们比较了Cz-WT和Cz-pkg在不同盐浓度下的生长、色素代谢、脂质积累和基因表达的差异。鉴于海水培养中的挑战，这项研究进一步确定了PKG作为盐胁迫适应的关键调节因子，并为优化海水培养提供了新的视角。结果明确了PKG在协调微藻生长和代谢产物合成中的调节功能，支持提高盐耐受性和提高高价值代谢产物产量的策略，以及培育耐盐、高产作物的方法。

藻类菌株和培养

本研究中使用的C. zofingiensis（ATCC 30412）来自美国典型培养物收藏中心，培养条件为16°C，使用Kuhl培养基（Huang, Lin等人，2018）。Cz-pkg是通过使用甲基硝基Nitrosoguanidine（MNNG）进行化学诱变从野生型获得的（Ren, Deng等人，2022）。Kuhl培养基的成分如下：KNO₃ 1.01 g/L，NaH₂PO₄·H₂O 0.62 g/L，Na₂HPO₄·2H₂O 0.089 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.247 g/L，CaCl₂·2H₂O 14.7 mg/L，Na₂EDTA·H₂O 6.95 mg/L，FeSO₄·7H₂O 6.95 mg/L，H₃

100 mM NaCl对Cz-WT和Cz-pkg生长和生物量积累的差异影响

在之前的研究中，通过MNNG介导的化学诱变产生了一种具有增强叶黄素积累能力的C. Zofingiensis突变株（命名为Cz-pkg），并通过高葡萄糖诱导筛选分离出来。在这些选择性条件下，Cz-WT由于酮类胡萝卜素的合成形成了橙红色菌落，而Cz-pkg形成了独特的绿色菌落，表明其无法积累这些色素，同时保持了稳定的光合色素谱型。

结论

本研究表明，PKG通过调节抗氧化防御和代谢适应，在Chromochloris zofingiensis中发挥增强盐胁迫耐受性的核心作用。我们的发现表明，Cz-WT中的功能性PKG通过上调关键类胡萝卜素生物合成基因（BKT2、CHYB）在200 mM NaCl条件下使虾青素积累增加了3.93倍；而在Cz-pkg中PKG的失活使代谢流向效果较差的抗氧化剂（叶黄素/玉米黄质），导致

未引用的参考文献

(Zhila等人，2010)

CRediT作者贡献声明

刘瑾：写作 – 审稿与编辑。叶颖：实验研究。孙涵：写作 – 审稿与编辑、监督、资金获取。黄俊超：写作 – 审稿与编辑、资源准备、方法学。郑洁：实验研究。杨书芳：软件操作、实验研究。王浩：实验研究。李志雄：方法学、实验研究。郭宇坦：写作 – 初稿撰写、实验研究、数据管理。袁媛媛：方法学、实验研究、概念构建。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本文得到了中国国家自然科学基金（32302059）、广东省自然科学基金（2024A1515011807）、山东省海洋水产养殖创新与创业社区计划（YZ2024002）、深圳市科技创新委员会（编号KQTD20180412181334790）和广东省珠江人才计划（2019ZT08H476）的财政支持。