《Journal of Biotechnology》：CaDoF10, a DNA-binding with one finger transcription factor from pepper, act as a positive regulator of cold stress tolerance
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DNA结合单指转录因子（DoF）在植物冷胁迫响应中起关键作用。本研究鉴定了辣椒33个CaDoF基因，发现CaDoF10在冷胁迫下显著上调且与拟南芥AtDoF1同源。通过VIGS沉默和Arabidopsis过表达验证，CaDoF10沉默植株冷胁迫敏感性增强，而过表达植株表现出更好的冷 tolerance，生理生化分析显示其通过调控抗氧化防御、膜稳定性及CBF相关基因实现冷适应。
伊克拉姆·乌拉（Ikram Ullah）、文涛·胡（Wentao Hu）、赛义德·索海尔·艾哈迈德（Syed Sohail Ahmad）、郭江白（Guo Jiangbai）、阿尔塔夫·侯赛因（Altaf Hussain）、佩英平（Yingping Pei）、张华峰（Huafeng Zhang）、萨蒂亚布拉塔·南达（Satyabrata Nanda）、陈如刚（Rugang Chen）
西北农林科技大学园艺学院，中国杨凌712100
摘要
据报道，植物中的单指DNA结合（DoF）转录因子在冷胁迫下会被诱导表达。然而，DoF在辣椒（Capsicum annuum L.）中的作用尚未得到充分研究。本研究通过对33个CaDoF的表达分析发现，多个CaDoF在冷胁迫下表达上调。CaDoF10在所有时间点的表达水平均显著高于其他CaDoF。此外，CaDoF10与AtDoF1的同源性最高，而AtDoF1已被报道参与拟南芥（Arabidopsis）的冷胁迫响应。因此，选择CaDoF10作为候选基因来探讨其在辣椒冷胁迫响应中的作用。CaDoF10的沉默导致冷响应基因CaCBF1A和CaRD29A的表达降低，使沉默植株的耐寒性减弱。进一步分析生理特性和抗氧化酶活性发现，CaDoF10沉默植株的耐寒性低于对照植株。相反，在转基因拟南芥中过表达CaDoF10可提高其对冷胁迫的耐受性。总体而言，这些结果表明CaDoF10作为冷胁迫响应的正向调节因子，为辣椒的抗逆性遗传改良提供了潜在靶点。
引言
冷胁迫是限制植物生长、发育和产量的主要非生物因素之一（Hou等，2020；Kumari等，2025）。为了应对这种逆境，植物进化出了复杂而有效的响应机制，包括膜脂质组成的改变、冷诱导的基因重编程、通过特定转录因子（TFs）调节基因表达以及保护性化合物的积累（Gao等，2022；Zhang等，2024b）。转录因子通过与其靶基因结合将外部胁迫信号传递给细胞（Rehman等，2024；Lan Thi Hoang等，2017）。许多转录因子家族，如MYB、bZIP、JAZ、WRKY、NAC和DoF，在植物抗非生物胁迫育种中具有巨大潜力（Chen等，2012；Tran等，2010；Mizoi等，2012；Nuruzzaman等，2013）。其中，DoF（单指DNA结合）是植物中的一个主要转录因子家族。DoF转录因子具有用于DNA结合的典型C2-C2-DoF结构域（Yanagisawa和Schmidt，1999；Guo等，2009；Cominelli等，2011；Corrales等，2014）。据报道，它们参与调节植物的多种关键生理过程，如萌发、发育、光周期响应、植物激素信号传导和胁迫耐受性（Chen等，2024）。例如，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，AtDof4.7被报道参与胁迫响应（Le Hir和Bellini，2013）。同样，在油茶（Camellia oleifera）中，ColDof1、ColDof2、ColDof14和ColDof36在盐胁迫和干旱胁迫下表达上调（Fu等，2024）。最近，RsDof33被确定为调控萝卜（radish）植物花青素生物合成和镉胁迫响应的候选基因（Gou等，2025）。此外，DoF也被报道参与调节多种植物的冷胁迫响应。在冷胁迫下，DoF可以通过ABA依赖/独立的方式以及ROS介导的信号通路被激活（Hwarari等，2022；Ren等，2023）。DoF通过促进ABA合成酶（如NCED3）和抗氧化防御基因（如SOD、CAT、APX）的表达来增强耐寒性（Hao等，2018）。此外，DoF调节碳水化合物代谢并维持渗透压平衡，以保护植物免受低温伤害（Kumar等，2021）。此外，DoF结合下游靶标启动子AAAG基序，影响冷诱导基因（如CBF基因）的表达（Meng等，2024）。因此，DoF作为关键因子，协调ABA、ROS和糖信号通路与CBF调控网络，优化植物在冷胁迫下的存活。此外，循环DoF因子（CDFs）这一DoF转录因子的特殊亚组在调节植物生理过程（包括胁迫适应）中的作用也得到了充分研究。例如，AtCDF3通过调节碳水化合物代谢、抗氧化活性和ABA响应基因表达来增强耐寒性、干旱性和盐胁迫性（Corrales等，2017；Renau-Morata等，2024）。同样，在萝卜、番茄、油菜和西瓜中，也报道了DoF/CDF蛋白的类似胁迫调节作用，它们在非生物胁迫下调节ROS平衡、渗透压调节和胁迫响应的转录网络（Ewas等，2017；Su等，2017；Zou和Sun，2023；Zhou等，2020；He等，2023；Carrillo等，2023）。最近的全基因组分析和功能研究进一步阐明了DoF/CDF转录因子在响应冷胁迫、干旱、盐胁迫和氧化胁迫中的作用，包括ABA依赖的信号传导、抗氧化调节和CBF相关通路（Fu等，2024；Zheng等，2024；Gu等，2024；He等，2025；Yang等，2026）。总体而言，这些研究表明DoF/CDF转录因子作为环境胁迫感知的枢纽，与下游保护机制（包括ABA信号传导、抗氧化防御和CBF介导的冷响应通路）相连接。辣椒（Capsicum annuum L.）是一种全球广泛种植的重要蔬菜作物，以其独特的风味和高营养价值而闻名（Hernández-Pérez等，2020；Palma和Terán，2020）。它含有高浓度的辣椒素、类胡萝卜素、黄酮类化合物和维生素，对人体健康有益（Reboul等，2007；Gao等，2022；Baenas等，2019）。然而，辣椒的生产受到多种非生物胁迫的严重制约，其中冷胁迫是温带和寒冷地区的主要因素（Ullah等，2025；Wang等，2022）。另一方面，基因组资源的增加和公开数据的可用性促使了许多研究探索辣椒基因组学，以了解许多关键的生理过程。在辣椒中，共鉴定出33个CaDoF，多个DoF参与响应热胁迫和盐胁迫（Cao等，2020；Wang等，2021）。然而，尚未有研究功能验证CaDoF在冷胁迫下的作用。因此，在本研究中，分析了所有33个已报道的CaDoF在冷胁迫下的表达，并选择CaDoF10作为进一步分析的候选基因。此外，还通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）对CaDoF10进行了亚细胞定位，并在拟南芥中过表达CaDoF10以研究其在冷胁迫下的功能。进一步进行了各种生理和生化分析，以强化CaDoF10在冷胁迫中的作用。总体而言，本研究展示了CaDoF10在冷胁迫耐受性中的作用，为辣椒的耐寒性遗传改良提供了新的视角。
实验材料与生长条件
实验材料包括拟南芥生态型Columbia-0、3个纯合转基因系以及耐寒辣椒品种P70，这些材料在西北农林科技大学园艺学院蔬菜植物生物技术和种质创新实验室（中国陕西杨凌；34°20′N，108°24′E）中培养。辣椒在黑暗条件下于28°C的湿润布上萌发5天。拟南芥在黑暗条件下于4°C预处理1天后，在24°C下萌发。
冷胁迫下CaDoF的表达动态
先前的全基因组鉴定研究在辣椒基因组中鉴定了33个CaDoF（Wu等，2016）。然而，它们在冷胁迫下的表达情况尚未被研究。本研究通过qRT-PCR分析了33个CaDoF在五个不同时间点（0小时、1小时、6小时、12小时和24小时）的表达情况，发现多个CaDoF在冷胁迫下表现出差异表达模式（图1）。例如，CaDoF10基因在1小时、6小时、12小时和24小时的表达显著上调。CaDoF10作为辣椒中的冷响应转录因子
在本研究中，选择CaDoF10作为候选基因，因为其在冷胁迫下多个时间点的表达显著上调，并且与已报道的拟南芥DoF（AtDoF1或AtDoF1.7）的同源性最高，这些DoF参与冷胁迫响应（Lijavetzky等，2003；Li等，2023）。此外，系统发育分类将CaDoF10和AtDoF1.7归为同一亚组，表明它们可能共同进化（图2）。随后的亚细胞分析进一步证实了这一点。结论
本研究报道CaDoF10是一种冷诱导的、定位于细胞核的转录因子，可正向调节C. annuum的耐寒性。通过VIGS介导的基因沉默和过表达在拟南芥中的功能分析表明，CaDoF10增强了光合作用稳定性，减少了膜损伤，并在冷条件下维持了氧化还原平衡。CaDoF10过表达株系中冷响应基因（CBF1、RD29A、KIN1和ERD15的表达上调，表明
伦理批准和参与同意
本研究未对动物或人类进行实验。对植物的实验，包括植物胁迫处理和样本收集，均符合机构、国家和国际指南。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号32172582和U24A20420）、陕西省农业关键科学技术计划（项目编号2024NC-YBXM-045）、中国博士后科学基金（项目编号GZC20241390）和陕西省博士后科学基金（项目编号2024BSHSDZZ171）的支持。CRediT作者贡献声明
陈如刚（Rugang Chen）：撰写、审稿与编辑、监督、资源管理、项目实施、资金获取、概念构思。萨蒂亚布拉塔·南达（Satyabrata Nanda）：撰写、审稿与编辑、监督、数据管理、概念构思。阿尔塔夫·侯赛因（Altaf Hussain）：数据管理。郭江白（Guo Jiangbai）：方法学。张华峰（Huafeng Zhang）：方法学、数据分析。佩英平（Yingping Pei）：方法学。赛义德·索海尔·艾哈迈德（Syed Sohail Ahmad）：方法学。文涛·胡（Wentao Hu）：方法学、数据分析。伊克拉姆·乌拉（Ikram Ullah）：撰写——初稿。利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。致谢
I.U. 感谢西北农林科技大学提供的博士生奖学金。同时，衷心感谢朱飞龙在载体构建方面的协助。
出版同意
不适用。
利益冲突
作者确认没有利益冲突。
