混合营养型反硝化作用在减少N?O排放方面的潜力：从电子分布角度的见解

《Journal of Cleaner Production》：The potential of mixotrophic denitrification for N 2O mitigation: Insights from the perspective of electron distribution

研究证实混合异养反硝化（MDN）在N?O减排方面显著优于单一模式，最高还原率达519.7 mg N/(gVSS·h)，且能维持稳定性能应对50%碳源冲击。最佳运行参数为COD/N=2.5和S/N=4.6，较传统异养反硝化降低26%化学药剂成本。通过电子分配调控和硫-有机协同代谢机制，MDN实现了高效且稳定的N?O减排。

　　

钱璐|刘英瑞|严敏|何艳颖|朱婷婷|陈雪明|倪冰洁|刘艺文

天津大学环境科学与工程学院，天津，300072，中国

摘要

混合营养反硝化（MDN）作为一种有前景的氮去除技术，因其低碳源成本和极少的硫酸盐排放而受到废水处理厂的关注。虽然反硝化作用在减少N₂O排放方面被认可为有效方法，但MDN的具体减排潜力仍不明确。本研究调查了MDN的N₂O减排能力和电子分布，揭示了其在减排方面的显著潜力以及对冲击负荷的强抵抗力。观察到的最大N₂O-N还原率为519.7 mg N/(gVSS × h)，显著高于最大NO₂^?-N还原率（101.3 mg N/(gVSS × h)），这突显了MDN在减少N₂O排放方面的有效性。尽管氮氧化物的电子竞争抑制了N₂O-N的还原速率，MDN仍保持了较高的N₂O-N消耗率。值得注意的是，MDN通过向N₂O还原酶传递电子而表现出稳定的N₂O减排性能。在有机碳或硫供应减少50%的情况下，其性能没有统计学上的显著变化。此外，在COD/N比为2.5和S/N比为4.6时，系统实现了最佳性能，具有最高的氮去除效率和优异的N₂O减排潜力。从经济角度来看，与异养反硝化相比，这种策略降低了26%的化学药剂投入成本。总体而言，本研究为MDN过程中的电子流动提供了基本见解，证明了其在测试条件下的显著减排潜力，并为未来高效N₂O减排策略的发展提供了理论基础。

引言

混合营养反硝化（MDN）作为一种新兴的氮去除技术，在工业废水处理、先进市政废水反硝化和 constructed wetland 治理中引起了广泛关注（Sun et al., 2020; Zhang et al., 2020, 2022b）。通过结合异养和自养反硝化途径，MDN有效克服了传统单一模式系统中的有机碳依赖性和二次污染问题（Zhang et al., 2022b, 2023; Zhou and Wang, 2024）。与异养过程相比，MDN通过使用经济的硫源替代大部分有机碳来源来降低运营成本，并减少了COD残留的风险（Chen et al., 2020b）。相对于基于硫的自养系统，MDN通过硫-有机协同代谢提高了反硝化速率并减少了硫酸盐积累（Jiang et al., 2023）。目前关于MDN的研究主要集中在硝酸盐去除效率、出水硫酸盐浓度和微生物群落组成上。例如，在硫-甲醇共电子供体系统中，C/N比为2.0时能够完全去除75 mg/L的NO₃^?-N，且出水中的硫酸盐浓度低于饮用水标准（<250 mg/L）（Sahinkaya and Dursun, 2012）。通过以1:1的质量比混合锯末和硫，成功实现了86.6%的氮去除效率，同时没有硫酸盐积累，并确认了自养和异养细菌的共存（Li et al., 2016）。在聚己内酯-硫复合填料中，异养/自养比例优化为1:2至2:1时，2:1的比例表现出更优的反硝化性能，且硫酸盐产生量低于基于硫的自养反硝化（SADN）（Tang et al., 2022）。Zheng et al.通过化学计量优化确定C/N/S比为1:1:0.4是最有效的氮去除摩尔比（Zheng et al., 2022）。此外，相关研究表明，在混合营养条件下，不同功能菌群之间存在复杂的非特异性互惠共生网络，可以通过利用中间产物或代谢废物实现稳定共存（Huang et al., 2021）。这种共生结构通过提高系统对冲击负荷的抵抗力增强了系统的稳定性（Sun et al., 2020）。然而，尽管对MDN性能进行了广泛评估，但有机碳或硫源对MDN内N₂O减排的影响仍不清楚。

一氧化二氮（N₂O）是一种强效的温室气体，其全球变暖潜力约为二氧化碳（CO₂）的265倍（Chen et al., 2019; He et al., 2026; IPCC, 2014; Lin et al., 2018; Wang et al., 2024）。据报道，N₂O占废水处理厂（WWTPs）相关碳足迹的近80%（Daelman et al., 2015; He et al., 2023; Li et al., 2024）。因此，有针对性的N₂O减排措施对于减少WWTPs的碳排放至关重要（Tong et al., 2024）。最近的研究表明，反硝化过程可以作为N₂O的重要汇（Conthe et al., 2019; Liu et al., 2025b）。然而，N₂O的还原和产生受到反硝化过程中电子供体浓度的影响（Li et al., 2025; Pan et al., 2013a）。在乙酸盐驱动的异养反硝化中，即使没有中间产物积累也能实现完全反硝化，且当COD/N比大于5时，N₂O的还原能力远超过其产生量（Conthe et al., 2019）。相反，当COD/N比低于3.5时，生物反应器中N₂O排放占进水中氮的20-30%（Itokawa et al., 2001; Mahmoud et al., 2022）。在甲醇和乙醇驱动的系统中观察到类似的现象，当碳源充足时，只有0.005%的硝酸盐转化为N₂O；而当COD/N比从4降至2时，这一比例增加到0.5%（Lu and Chandran, 2010）。在SADN中也观察到类似的调控模式，其中S/N比对N₂O的还原有关键影响。具体来说，S/N比从2.1降至1.4时，N₂O排放量从0.002%增加到0.405%，这归因于生产-降解动力学的失衡（Yang et al., 2016）。进一步的研究表明，提高S/N比可以有效缓解N₂O还原能力的抑制。值得注意的是，将S/N比从0.8提高到2.5后，N₂O的还原速率从6.8 mg N/(gVSS × h)提高到15.5 mg N/(gVSS × h)，突显了电子供体可用性的关键作用（Yang et al., 2016）。

从机制上讲，有机/无机电子供体浓度对N₂O积累的影响主要归因于反硝化过程中反硝化还原酶的竞争（Pan et al., 2013a）。反硝化过程包括四个连续的还原步骤：硝酸盐（NO₃^?）依次还原为亚硝酸盐（NO₂^?）、一氧化氮（NO）、一氧化二氮（N₂O），最终生成氮气（N₂）（Liu et al., 2025b; Zumft, 1997）。每个步骤都由相应的酶催化，如硝酸盐还原酶（Nar）、亚硝酸盐还原酶（Nir）、一氧化氮还原酶（Nor）和一氧化二氮还原酶（Nos）。关键的是，所有还原酶都共享同一个电子供应源——泛醌池（UQ/UQH₂）（Pan et al., 2013a, 2013b）。来自有机或无机供体氧化的电子主要进入泛醌池（UQ/UQH₂），然后转移到细胞色素cc550（Cytc550）。Nar可以直接从醌池接受电子来还原NO₃^?，而Nir和Nos则依赖Cytc550进行电子转移（Liu et al., 2025a）。由于Nos的电子亲和力相对较弱，它通常从电子池获得的电子不足，导致N₂O还原不完全并积累。这一结果使得完全反硝化对供体可用性的波动非常敏感（Liu et al., 2022; Oberoi et al., 2021）。值得注意的是，异养反硝化（HDN）系统通常表现出更强的N₂O减排能力。在充足的有机碳供应下，HDN的N₂O还原速率可达70-400 mg N/(gVSS × h)，比SADN系统（2.5-3 mg N/(gVSS × h)高出两个数量级。在相同的供体可用性下，HDN中Nos的电子分配比例为65-80%，而SADN中为15-50%（Liu et al., 2022; Oberoi et al., 2021; Zhu et al., 2023）。这一优势使HDN系统能够将N₂O的减排量降低到其产生的2-10倍，从而成为一个有效的N₂O汇。最近的研究还表明，基于硫的混合营养系统在COD/N质量比为3.1-3.5和S/N摩尔比为2.0-2.1时可以实现完全硝酸盐去除，且N₂O还原速率超过30 mg N/(gVSS × h）（Zhang et al., 2024b）。为了解决这一差距，我们提出MDN系统将HDN的N₂O汇能力和SADN的成本控制优势结合起来。此外，MDN系统固有的复杂微生物结构可能增强系统对碳/硫波动的稳定性，同时保持强大的N₂O减排能力。

本研究旨在探讨MDN系统在减少N₂O排放方面的潜力。通过一系列批次实验，从电子竞争的角度探讨了N₂O的产生和还原过程。首先，开发了一个结合了富乙酸盐和富硫代硫酸盐反硝化菌的MDN系统。随后，在乙酸盐和硫代硫酸盐充足的条件下，分析了不同电子受体组合下的实际氮氧化物还原速率、电子消耗速率以及氮氧化物之间的电子分布。此外，还在不同的乙酸盐或硫代硫酸盐浓度下进行了批次实验，以评估有机碳或无机硫电子供体对N₂O转化的影响。最后，本研究通过整合微生物群落结构，探讨了电子竞争的潜在机制，并评估了MDN作为N₂O减排途径的潜力。这些发现为优化MDN过程以减少N₂O提供了关键的理论见解，并为电子供体补充策略的改进提供了依据。

反应器设置和操作参数

建立了两个结构相同的实验室规模序批反应器（SBRs），每个反应器的工作体积为4 L。反应器中的活性污泥来自中国天津的一个生活污水处理厂。然后选择性地富集这些反应器以培养不同的微生物群落：R1喂食乙酸钠以培养异养反硝化菌群，而R2喂食硫代硫酸盐以富集自养、硫氧化菌群

MDN的微生物群落特征

我们研究中观察到的混合营养微生物群落组成（图1）与以往研究在门和属水平上的发现一致（Sun et al., 2020; Zhang et al., 2022b, 2023）。在门水平上，鉴定出三个主要的门：Proteobacteria、Bacteroidota和Chloroflexi，相对丰度分别为48.2%、25.4%和11.5%。值得注意的是，Proteobacteria始终是MDN生物反应器中的主要门

讨论

MDN提供了一种比HDN更具成本效益的替代方案，并解决了SADN中的硫酸盐产生问题（Zhang et al., 2023）。本研究强调了MDN在N₂O减排方面的未充分探索的潜力，证明了其在不同有机碳和硫代硫酸盐条件下的有效氮去除能力。经济分析进一步证实了MDN的成本效益，强调了其在大规模废水处理中的实际优势。

从机制上讲，我们的发现表明

结论

本研究表明，MDN在废水处理中具有显著的N₂O减排潜力。MDN的N₂O-N还原率是NO₂^?-N的五倍，即使在电子受体竞争的情况下这一优势仍然存在。值得注意的是，尽管供体浓度波动，MDN仍表现出稳定的N₂O还原性能，且Nos的电子分配没有统计学上的显著变化。在COD/N比为2.5和S/N比为4.6时，系统保持了高N₂

CRediT作者贡献声明

钱璐：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，研究，数据管理，概念化。刘英瑞：验证，方法学，正式分析，数据管理。严敏：方法学，研究。何艳颖：验证，方法学。朱婷婷：撰写 – 审稿与编辑，监督，方法学，研究，概念化。陈雪明：撰写 – 审稿与编辑。倪冰洁：撰写 – 审稿与编辑。刘艺文：撰写 – 审稿与编辑，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（项目编号：2024YFC3810200）和国家自然科学基金（项目编号：52470108）的资助。