一种高灵敏度的分子印迹电化学发光传感器，用于定量检测多米酸

《Journal of Electroanalytical Chemistry》：A highly sensitive molecularly imprinted electrochemiluminescence sensor for quantitative detection of domoic acid

本研究开发了一种基于分子印迹的电化学发光传感器，采用Ru(bpy)?2?掺杂二氧化硅纳米颗粒作为发光体，并利用1,3,5-戊三酸伪模板策略制备分子印迹聚合物。该传感器在复杂海洋环境中实现DA的高灵敏检测（线性范围10-10,000 ng/mL，检测限3.08 ng/mL），为藻毒素监测提供了新方法。

　　

吕月玲|韩婷婷|庄金阳|刘金霞|刘欣|沈光辉|王淑芳|史建荣|徐建宏|朱俊杰

中国江苏海洋大学海洋科学与渔业学院海洋生物资源与环境重点实验室，连云港222005

摘要

作为导致贝类失忆性中毒的神经毒素，软骨藻酸（DA）会引发不可逆的海马体损伤，从而导致持续的记忆缺陷。然而，由于现有分析方法的灵敏度有限且背景干扰明显，准确检测贝类毒素DA仍然面临重大挑战。本文报道了一种新型分子印迹电化学发光（MIP-ECL）传感器，该传感器具有精心设计的识别位点，能够实现高灵敏度的DA定量。这种创新传感器采用掺杂Ru(bpy)₃²⁺的二氧化硅纳米颗粒（Ru@SiO₂）作为高性能ECL发射体，并使用1,3,5-戊三羧酸作为替代高毒性且昂贵的目标分子DA的模板，从而能够在包括海水和海鲜样品在内的复杂海洋环境中精确检测DA。所开发的MIP-ECL传感器对DA在10–10,000 ng/mL的宽线性范围内表现出优异的灵敏度，检测限为3.08 ng/mL（信噪比=3）。这项工作为贝类毒素监测建立了一个创新且可靠的分析平台，为提升食品安全监测和公共卫生措施提供了科学依据。

引言

贝类毒素是一类由有毒有害藻类产生的生物活性化合物，对海洋渔业资源和水产养殖以及海洋环境造成严重破坏。更令人担忧的是，这些毒素可以通过食物链在人体内积累，导致中毒甚至死亡，对公共卫生构成严重威胁[1]。其中，软骨藻酸（DA）是一种主要由Pseudo-nitzschia硅藻产生的天然氨基酸兴奋性神经毒素，是导致贝类失忆性中毒的主要成分[2]。人类食用受DA污染的贝类可能引发头晕、呕吐、记忆障碍、昏迷甚至死亡等不良健康后果[3]。自1987年首次记录到DA中毒致死案例以来，全球范围内不断有相关中毒事件和死亡案例报告[4]、[5]。为此，许多国家和地区相继实施了可食用贝类中DA含量的严格限制，20 μg/g被普遍认为是安全阈值[6]。因此，对贝类和水生环境中DA浓度的严格监测对于保障食品安全和生态系统健康至关重要。

近年来，已经开发了几种传统的DA检测分析技术，包括高效液相色谱（HPLC）[7]、酶联免疫吸附测定（ELISA）[8]、毛细管电泳（CE）[9]和小鼠生物测定[10]。然而，这些技术存在操作繁琐和检测成本高等缺点，限制了其在实际应用中的发展。值得注意的是，基于光学和电化学的检测方法（如荧光、电化学等）近年来因成本低、操作简便和优异的分析性能而受到广泛关注[11]、[12]。尽管如此，这些新兴方法仍面临一些挑战，尤其是信号背景干扰较大和检测灵敏度受限的问题，这限制了它们进行精确定量测定的可靠性。因此，迫切需要开发一种高灵敏度、低背景的新型检测方法，以实现DA的准确快速检测。

电化学发光（ECL）是一种通过电化学反应引发的发光过程，由于其显著的灵敏度、宽动态范围和低背景干扰，已成为食品和生物学领域中强大的分析工具[13]、[14]、[15]、[16]。在各种ECL系统中，三(2,2′-联吡啶)钌(II)（Ru(bpy)₃²⁺）因其高ECL效率、优异的电化学可逆性和良好的生物相容性而被广泛认为是ECL应用中最有优势的发光剂[17]。迄今为止，已经开发了许多将Ru(bpy)₃²⁺固定在固体电极表面的方法，例如层叠组装、溶胶-凝胶化学[18]、[19]。其中，二氧化硅纳米颗粒因其易于修饰和功能化的表面而被认为是一种非常通用的基质，可以有效地固定各种ECL发光剂（如量子点等），同时保持其固有的光学性质，防止泄漏，从而提高稳定性[20]、[21]。因此，掺杂Ru(bpy)₃²⁺的二氧化硅纳米颗粒（Ru@SiO₂）已成为制备传感器的理想选择，因为将Ru(bpy)₃²⁺分子封装在二氧化硅基质中可以有效地保护其免受环境干扰，并使每个纳米颗粒内负载高密度的发光分子，显著减少发光试剂的消耗并增强ECL信号。

具有分子识别能力的分子印迹聚合物（MIPs）是通过分子印迹技术制备的功能性材料，在评估传感器性能方面起着关键作用[22]。凭借其高选择性、优异的化学稳定性和低成本效益，MIPs已成功应用于食品领域，成为传统生物抗体的理想替代品[23]。最近，基于MIPs的ECL传感器结合Ru@SiO₂纳米材料已被成功开发用于多种分析物的定量检测，包括伏马毒素B1[24]、肌酐[25]和赭曲霉毒素A[26]，这得益于其高选择性和灵敏度。遗憾的是，目前尚未有关于MIP-ECL检测贝类毒素DA的报道。直接使用DA作为MIPs合成的模板受到其高成本和强毒性的限制。伪模板策略作为一种可行的解决方案应运而生，使用1,3,5-戊三羧酸（PTA）作为替代模板，在MIPs制备过程中有效模拟目标分子[27]。结果表明，由此制备的MIPs对DA表现出优异的选择性和识别能力，在复杂的海鲜基质中具有重要的应用前景[28]、[29]。

本文开发了一种新型MIP-ECL传感器，具有精确设计的识别位点，可用于敏感和选择性地检测贝类毒素DA。该ECL传感器结合了Ru@SiO₂作为高效ECL发射体，并使用1,3,5-戊三羧酸（PTA）作为模板制备针对DA的MIPs（图1）。所设计的MIP-ECL系统能够在包括海水和海鲜样品在内的复杂海洋环境中实现高度特异性的DA检测。该MIP-ECL传感器表现出出色的分析性能，具有宽线性检测范围和满意的检测限。这项工作不仅提供了一个用于监测贝类毒素的新型可靠ECL传感平台，还为完善食品安全协议和公共卫生保护措施奠定了坚实的科学基础。

化学物质和材料

三(2,2′-联吡啶)二氯钌(II)六水合物（Ru(bpy)₃Cl₂·6H₂O）、三丙胺（TPA）、氢氧化铵（NH₃·H₂O）、四乙基正硅酸盐（TEOS）、4-乙烯基吡啶（4-VP）、1,3,5-戊三羧酸（PTA）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、2,2′-偶氮二(2-甲基丙腈）（AIBN）、Span80、Tween80、壳聚糖（CS，脱乙酰度≥95%）、无水乙醇、甲醇、乙酸和乙腈均购自Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.（上海）。

Ru@SiO₂和MIPs的表征

Ru@SiO₂的形态通过透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）进行了表征。TEM和SEM结果显示，制备的Ru@SiO₂分布均匀，呈现出明确的球形形态（图1A, B）。其平均粒径约为363 nm（图1C）。此外，还通过紫外-可见光吸收和光致发光（PL）光谱研究了Ru@SiO₂的光物理性质。

结论

总之，我们成功开发了一种基于伪模板MIP策略的稳健且高选择性的ECL传感器，用于贝类毒素DA的痕量检测。通过使用Ru@SiO₂作为高效ECL发射体和合成的MIPs作为特异性识别元素，该传感器在包括海水和海鲜样品在内的复杂基质中实现了对DA的高度选择性和灵敏度识别。在优化条件下，该传感器实现了广泛的

CRediT作者贡献声明

吕月玲：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，研究，概念构思。韩婷婷：撰写 – 审稿与编辑，方法学，资金获取，概念构思。庄金阳：方法学，正式分析。刘金霞：撰写 – 审稿与编辑，资金获取。刘欣：资金获取，正式分析。沈光辉：撰写 – 审稿与编辑，资金获取。王淑芳：撰写 – 审稿与编辑，监督。史建荣：撰写 – 审稿

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者衷心感谢中国国家重点研发计划（2024YFF1105802）、国家自然科学基金（32372454、32402257和82402747）、江苏省农业科技创新基金（CX(23)1002）、国家分析化学生命科学重点实验室基金（SKLACLS2509）以及国家谷物及其产品质量安全重点实验室开放项目的财政支持。