阐明阳离子在克雷伯菌生物膜与环境-临床界面中的作用及相关基因的影响

《Journal of Environmental Sciences》：Elucidating the effect of cations in environmental-clinical interface of Klebsiella biofilm and related genes

Klebsiella pneumoniae生物膜形成受K+、Ca2+等阳离子调控，wabG基因介导的脂多糖（LPS）合成是驱动生物膜的关键机制，为尿路感染治疗提供新靶点。

　　

作者：Aravind Murugavel, Srinithi Gunasekaran, Jayapradha Ramakrishnan

印度泰米尔纳德邦坦贾武尔Tirumalaisamudram市SASTRA大学化学与生物技术学院传染病研究中心（CRID）的放线菌生物勘探实验室

摘要

关于Klebsiella生物膜在尿路感染（UTI）中的确切作用仍不清楚，特别是环境生存策略如何转化为临床毒力。当氮源被消除后，含有碳源（葡萄糖）和阳离子的培养基会促进Klebsiella生物膜的形成。在测试的阳离子中，K⁺和Ca²⁺在pH值为6.5到9.5的条件下能够促进临床和环境分离株的生物膜形成。同时，这些离子增加了Klebsiella的荚膜大小和细胞密度，但与生物膜质量无关。无论是在浮游状态还是生物膜状态下，脂多糖（LPS）基因（wabG）的表达都能在K⁺、Ca²⁺和Na⁺的存在下促进生物膜的形成。而菌毛基因（fimH和mrkD）的表达是共调节的，荚膜基因（rmpA和wcab）则没有这种效应。这表明，对于Klebsiella生物膜来说，主要成分不是荚膜或菌毛，而是LPS。因此，LPS是驱动环境与临床界面生物膜形成的关键因素。基于此，wabG成为治疗尿路感染中Klebsiella生物膜的一个潜在靶点。据我们所知，这是首次研究阳离子对Klebsiella生物膜和浮游细胞影响的研究，并展示了LPS生物合成基因（wabG）在生物膜形成中的作用。

引言

Klebsiella pneumoniae是一种机会性病原体，具有重要的毒力因子，包括荚膜多糖（CPS）、1型和3型菌毛、脂多糖（LPS）和铁载体。表达CPS和菌毛的菌株能够强烈附着在非生物和生物表面上，从而促进生物膜的形成（Di Martino等人，2003；Huang等人，2022；Ruiz等人，1993）。LPS在维持细胞完整性和通透性方面起着重要作用，同时限制有毒物质的渗透（Farhana和Khan，2024）。然而，它对生物膜形成的具体贡献仍需进一步探索。生物膜为K. pneumoniae提供了显著的生存优势，包括比浮游细胞更强的抗吞噬活性和对抗菌治疗的抵抗力，这些因素共同导致了治疗失败，并引发了全球性的健康问题（Rathore等人，2022）。与生物膜相关的K. pneumoniae感染在医疗环境中很常见，包括中心静脉导管相关血流感染、尿路感染（UTI）、气管插管定植和呼吸机相关肺炎。其中，尿路感染是全球最常见的医疗相关感染之一，每年影响约1.5亿人，其中Escherichia coli是最主要的致病菌，K. pneumoniae紧随其后。未经治疗的尿路感染可能发展为菌血症，导致尿路上皮细胞损伤和全身性感染。值得注意的是，在菌血症期间，生物膜的持续存在被认为是导致发病率和死亡率的关键因素（Flores-Mireles等人，2015）。因此，深入了解K. pneumoniae生物膜形成的分子机制对于开发针对性的治疗干预措施至关重要。

除了内在的细胞因素外，环境条件在调节生物膜形成中也起着关键作用。诸如温度、pH值、氧气可用性、尿素和离子浓度等物理化学参数已被证明可以影响多种细菌的生物膜发展。阳离子的平衡尤为重要，因为特定离子如Zn(II)、Mn(II)和Fe(II)在0.4-1 mmol/L的浓度下可以促进细菌生长，而阳离子缺乏或过量则会抑制生长并改变细胞生理（McDevitt等人，2011；Gonciarz和Renslo，2021）。阳离子对生物膜形成的调控作用已在包括Bacillus subtilis、Staphylococcus aureus、Pseudomonas fluorescens和Exiguobacterium等多个物种中得到研究（Pavez等人，2023；Sharipova等人，2023；Song和Leff，2006）。然而，阳离子对Klebsiella生物膜形成的影响及其相关分子机制仍大部分未得到探索。考虑到尿路感染中离子浓度在生理和病理情况下都会波动，这一点尤为重要。

除了医疗环境外，K. pneumoniae还栖息在多种环境基质中，包括淡水、废水、水生生态系统和土壤中，在这些环境中它会在非生物表面上形成持久的生物膜（Barati等人，2016；Hsieh等人，2025；Podschun等人，2001）。这些环境中的K. pneumoniae》菌株可作为人类机会性感染的来源，其毒力和生物膜形成能力与临床菌株相当（Podschun等人，2001）。尽管如此，关于K. pneumoniae如何在这些栖息地中生存和持续存在，仍存在基本的知识空白。它能够在多样化的环境生态系统中和人体内繁衍，这表明它具有适应性策略。因此，我们假设环境中的矿物质（阳离子）是其环境适应性的关键因素，但目前尚未得到研究。探讨这一联系将有助于解释环境适应性机制如何促进其在尿路感染中的致病性。

遗传学研究系统地描述了生物膜形成的三个主要结构组分的遗传基础。i) 胶囊多糖（CPS）合成：在参与胶囊合成的134个K-位点中，转座子（wza和wzc）和合成基因（treC, magA, rmpA, rmpA2, wcaG）的突变会导致生物膜形成缺陷（Balestrino等人，2008；Ho等人，2011；Wu等人，2011；Zheng等人，2018）。rmpA基因编码一个调节多种血清型的胶囊调节因子。ii) 菌毛介导的附着：1型和3型菌毛由fim和mrk基因簇控制，fimH和mrkD编码的粘附蛋白可促进强烈的生物膜形成（Alcántar-Curiel等人，2013；Fang等人，2021）。iii) LPS生物合成：在LPS途径中，waaC和waaF的突变会导致中度LPS缺陷，而删除wabG基因（调节果糖生物合成）会导致完全的LPS生产失败（Izquierdo等人，2003）。尽管荚膜和菌毛已被充分研究，但LPS在生物膜调节中的作用及其对环境信号（如阳离子可用性）的响应机制仍不清楚。

虽然其他细菌的生物膜形成受到离子调控的描述，但K. pneumoniae中特定菌株和基因水平上驱动阳离子响应性生物膜形成的机制尚未明确。此前没有研究系统地考察过（i）来自尿路、血流和环境来源的临床相关菌株的阳离子效应；（ii）模拟正常和病理尿液以及典型淡水硬度的生理相关钙范围（2.5-7.5 mmol/L）；或（iii）这些离子如何选择性地影响临床-环境界面上的胶囊、菌毛或LPS生物合成途径。

为了解决这些空白，我们整合了定量生物膜测定、剂量-反应分析和基因表达谱分析，对来自尿路、血流和环境来源的七种K. pneumoniae分离株进行了研究，以确定临床和环境背景下生物膜形成的主要阳离子响应决定因素。

研究使用的菌株

共测试了七种K. pneumoniae菌株，其中四种为尿路致病菌株（kp1(ACCN: MCC5428, kp2 (ACCN: MCC5427, kp3 (ACCN: MCC5426)），来自浦那的D.Y. Patil医院和研究中心；两种血液分离株（BA 33569和BA 28434）来自韦洛尔的Christian Medical College (CMC)；一种临床参考菌株（kp5）来自昌迪加尔MTCC；以及一种环境菌株（kp4）。为了初步鉴定，所有菌株都在Hi-Crome UTI琼脂培养基上生长（Lalitha等人，2017）

Ca²⁺和K⁺离子促进Klebsiella生物膜的形成

与对照组（葡萄糖）相比，K. pneumoniae的环境和临床分离株在特定阳离子存在下表现出更强的生物膜生长。在测试的菌株中，BA 33560在K⁺存在下形成的生物膜最多（66%），其次是kp3（在Ca²⁺下为65%），kp2（在Na⁺下为57%），kp1（在Ca²⁺下为56%），kp5（在AS下为50%），BA 28434（在Ca²⁺下为48%），kp4（在K⁺下为43%）。这种中间表型表明，环境中的K. pneumoniae（kp4）仍保留了与临床菌株相当的生物膜形成能力

讨论

Klebsiella pneumoniae在临床环境之外的环境中普遍存在，包括淡水系统、污水处理厂、土壤以及水分配系统中的非生物表面。这些多样化的环境作为人类感染的来源，主要通过受污染的饮用水和接触水的活动传播。关键的是，促进临床生物膜形成的生理机制似乎是保守的

结论

从这项研究中我们发现，Ca²⁺和K⁺促进了Klebsiella生物膜的形成。然而，在生物膜大小、菌落结构和细胞密度方面观察到了显著的变化。有趣的是，增加Ca²⁺浓度会抑制Klebsiella生物膜的生长，表明这是在分子水平上的调节作用，而不仅仅是细胞与表面之间的简单静电相互作用。

观察到直接的相关性

未引用的参考文献

Cruz, 2013

附录A 补充数据

与本文相关的补充数据可以在在线版本中找到（网址：xxxxx）。

数据可用性

本研究生成或分析的所有数据都包含在本文及其补充数据中。

作者贡献声明

Aravind Murugavel进行了所有实验并分析了结果。Srinithi Gunasekaran在不同pH值和Ca²⁺浓度下研究了生物膜的发展。Jayapradha Ramakrishnan负责获取资金并设计了实验。手稿由Aravind Murugavel和Jayapradha Ramakrishnan共同撰写和验证。

伦理批准

本研究未涉及人类受试者或人类来源的材料。

作者贡献声明

Aravind Murugavel：写作 – 审稿与编辑，原始草稿撰写，可视化，验证，软件使用，方法学，实验设计，数据分析，数据管理。Srinithi Gunasekaran：方法学。Jayapradha Ramakrishnan：写作 – 审稿与编辑，原始草稿撰写，可视化，验证，监督，资源管理，项目协调，资金获取，数据分析，概念化。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了SASTRA Deemed University的支持（资助编号[SASTRA-TRR-SCBT-4]，作者Jayapradha Ramakrishnan也获得了研究支持。作者感谢SASTRA大学提供的财务支持，以及M. J. Nishanth博士在基因表达分析方面的专业指导