《Advanced Science》：Dual-Key Genetic Circuit Enables Stable and Self-Regulated Engineered Bacteria for the Treatment of Ulcerative Colitis
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本研究报道了一种创新的“双钥”基因回路设计，通过在工程菌中构建依赖双质粒补偿的生存机制，成功实现了无抗生素条件下的质粒稳定、可控的细菌群体裂解以及治疗蛋白的持续递送，为溃疡性结肠炎等免疫黏膜疾病的活菌疗法提供了安全、稳定且可编程的新策略。
引言：工程菌疗法的挑战与创新
溃疡性结肠炎是一种慢性、复发性胃肠道疾病，传统疗法难以解决其核心的免疫失衡、屏障功能障碍和肠道菌群失调问题。大肠杆菌尼氏1917作为一种公认安全的益生菌，是工程化改造的理想底盘，可用于递送治疗性基因或合成功能分子。然而，在体内代谢压力下，工程菌中的质粒容易丢失，导致疗效下降。现有的质粒稳定策略，如使用抗生素或基于单基因缺陷的平衡致死系统，往往存在破坏肠道菌群、诱导耐药性或长期有效性不足等局限。为此，本研究旨在开发一种无需抗生素、能实现质粒稳定、精确种群控制和持续治疗蛋白分泌的新型工程菌系统。
双钥基因回路的设计与构建
研究的核心是建立一个合成的“双钥”基因回路。研究团队利用λ-Red重组技术，敲除了EcN基因组中的asd和thyA基因，构建了双营养缺陷型底盘菌株EcNΔasdΔthyA。asd基因编码DAP合成的关键酶，其缺失会导致革兰氏阴性菌细胞壁缺陷和快速裂解；thyA编码胸苷酸合成酶，其缺失会损害DNA复制，导致细胞死亡。这意味着改造后的菌株自身无法独立存活，其生存严格依赖于同时引入两个分别补偿这两种缺陷的质粒，即“双钥”设计。
其中一个质粒是“裂解模块”，它恢复了asd功能，并整合了基于LuxI/R的群体感应系统，用于自我调控裂解和控制蛋白释放（“一键”）。该系统在细菌定植达到临界密度时，会启动噬菌体裂解基因?X174E的表达，使工程菌发生程序性裂解，脉冲式释放功能蛋白。另一个质粒是“表达模块”，它补偿了thyA功能，并共递送了治疗性蛋白：一种白细胞介素-2突变体（IL-2 mut）和来自阿克曼氏菌的膜蛋白Amuc_1100（“双钥”）。这种设计确保了只有在两个质粒同时存在时，工程菌才能存活并表达功能蛋白（“开”状态）；任一质粒丢失都会导致细菌死亡（“关”状态），从而在无抗生素条件下实现了极高的质粒稳定性。此外，研究还利用CRISPR/Cas9技术消除了EcN中内源性质粒pMUT1和pMUT2，以增强外源基因的表达。
治疗蛋白的功能与选择
针对溃疡性结肠炎的免疫失衡和屏障损伤两大核心问题，研究选择了两种治疗蛋白。IL-2是调节性T细胞生存和功能的关键因子，但高浓度的野生型IL-2会非选择性激活效应T细胞和自然杀伤细胞，导致全身免疫激活。为此，研究采用了IL-2突变体，其上的N103R和V106D突变可特异性降低与受体CD122的亲和力，从而选择性地激活高表达CD25的Tregs，避免副作用。计算模拟（MutaBind2和AlphaFold2）证实了这些突变能显著降低与CD122的结合能。
Amuc_1100则能增强肠道上皮细胞紧密连接蛋白的表达，从而修复和强化肠道屏障。这两个蛋白被共同构建在表达质粒上，实现了对免疫调节和屏障修复的双重干预。
工程菌的修饰与体内递送
为保护口服的工程菌免受胃酸破坏，研究采用肠溶材料L100-55对细菌进行包被。这种材料在胃的酸性环境中保持完整，在肠道的近中性环境中溶解，从而实现了细菌的靶向递送和释放。体外实验表明，L100包被能有效保护细菌在模拟胃酸中的活性。体内生物发光成像也证实，包被后的工程菌能更有效地定植于肠道。
体外功能验证与体内疗效评估
体外实验证实，该双钥工程菌系统能周期性地生长和裂解，并持续释放功能蛋白。从工程菌裂解上清中收集的蛋白，在细胞实验中显示出明确的生物学功能：IL-2突变体能特异性促进脾脏Tregs的扩增，而不激活效应T细胞；Amuc_1100能增强肠上皮细胞Caco-2中紧密连接蛋白ZO-1的表达，并降低单层细胞的通透性。这些结果证明了工程菌释放的蛋白具备预期的免疫调节和屏障修复功能。
在葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型中，口服给予最终的工程菌制剂能显著缓解疾病症状，包括减轻体重下降、降低疾病活动指数、促进结肠长度恢复、减少组织损伤。FITC-葡聚糖灌注实验表明，治疗显著降低了结肠通透性，说明肠道屏障功能得到修复。组织学分析和免疫荧光染色进一步显示，治疗促进了结肠组织中黏液蛋白MUC2以及紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达，证实了屏障修复效果。
免疫调节机制与菌群调控
在免疫机制层面，工程菌治疗显著增加了结肠固有层中Tregs的数量，同时减少了中性粒细胞等促炎免疫细胞的浸润。结肠组织中促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6的水平下降，而抗炎细胞因子转化生长因子-β和白细胞介素-10的水平上升。髓过氧化物酶活性降低，CD8+T细胞浸润减少，这些都表明结肠组织的炎症得到有效抑制，免疫平衡得以恢复。
此外，工程菌治疗还能调节紊乱的肠道菌群。16S rDNA测序分析表明，治疗部分逆转了DSS诱导的菌群失调，抑制了促炎菌属，并恢复了有益菌如乳杆菌的丰度，有助于重建健康的肠道微环境。
生物安全性与讨论
生物安全性评估显示，工程菌治疗未引起小鼠血清生化、血常规的显著异常，也未在主要器官造成病理损伤，表明其具有良好的生物相容性。本研究构建的双钥基因回路系统，通过将细菌生存与双质粒补偿严格耦合，并结合群体感应裂解模块，实现了无需抗生素的质粒长期稳定、精确的细菌种群控制以及治疗蛋白的按需释放。该系统通过协同递送IL-2突变体和Amuc_1100，同时针对溃疡性结肠炎的免疫失衡和屏障损伤进行干预，在动物模型中显示出显著疗效。这种模块化、可编程的设计思路，不仅为溃疡性结肠炎的治疗提供了新策略，也为扩展工程菌疗法至其他免疫和黏膜疾病奠定了坚实基础。
