连翘（Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl）的靶点预测与验证：用于改善阿尔茨海默病

《Journal of Molecular Liquids》：Target prediction and validation of Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl for improving Alzheimer's disease

阿尔茨海默病（AD）中Tau蛋白过度磷酸化是关键病理特征。通过网络药理学结合分子对接、光谱分析和分子动力学模拟，从连翘（Forsythia suspensa）中筛选出11种潜在化合物，发现AKT1酶是AD的核心靶点。槲皮素、连翘苷和黄连素能激活AKT1活性，通过氢键等作用稳定结合于其PH结构域，显著抑制Tau蛋白磷酸化，其中槲皮素效果最佳。

　　

林从焕|任艳|张立伟|杜慧智

山西大学分子科学研究所，教育部化学生物学与分子工程重点实验室，太原030006，中国

摘要

阿尔茨海默病（AD）的典型病理特征之一是Tau蛋白的过度磷酸化。通过网络药理学技术，筛选出了11种来自连翘（Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl）的潜在化合物，发现AKT1（参与Tau蛋白磷酸化的关键酶）是AD的治疗靶点。其中，木犀草素、菲利林和ビククリン与AKT1激动剂SC79类似，通过结合AKT1的PH结构域来促进AKT1的活性，这一点通过分子对接实验得到了证实。此外，由于这些化合物与AKT1的结合能略高于SC79，它们主要通过氢键等作用方式与AKT1结合得更紧密。光谱分析显示，这三种化合物均能与AKT1形成复合物，从而抑制AKT1的荧光，其中木犀草素和ビククリン对AKT1上的TYR残基的抑制作用尤为显著。分子动力学模拟进一步表明，这些化合物与AKT1的结合发生在AKT1的SER-473活性中心附近，且形成的复合物具有相对稳定的构象。总之，连翘中的木犀草素、菲利林和ビククリ林能够促进AKT1的活性，从而减少Tau蛋白的过度磷酸化，进而改善AD症状，其中木犀草素的疗效最佳。

引言

阿尔茨海默病（AD）是一种神经退行性疾病，其特征是进行性记忆丧失和认知功能障碍，是老年人痴呆最常见的原因之一[1]。全球约有5000万人患有AD，随着人口老龄化，预计到2050年这一数字将增加三倍，带来巨大的护理负担和医疗费用[2]。AD的典型组织病理学特征包括由β-淀粉样蛋白（Aβ）聚集体引起的细胞外斑块积聚、主要由过度磷酸化和错误折叠的Tau蛋白组成的细胞内神经纤维缠结以及胆碱能神经递质缺乏等[3]。从机制上看，AD与神经元死亡、特定神经递质水平下降、突触丢失和神经炎症有关[4]。现有的药物主要包括乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）拮抗剂和针对Aβ的单克隆抗体，它们仅通过作用于单一靶点来缓解AD症状[5]。因此，迫切需要开发多靶点药物。

天然产物及其衍生物具有多靶点抗AD作用，同时毒性低且价格亲民，已成为药物发现中的有希望的先导化合物[5],[6],[7]。连翘（Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl）的果实在中国被称为“连翘”，是一种传统中药，几个世纪以来一直以其消肿散结、清热解毒的功效而闻名[8]。连翘的主要成分包括木脂素和苯乙素苷类（如连翘苷、菲利林、芦丁和菲利根宁），以及黄酮类、生物碱和甾体等[9]。其中，前两种成分是该植物的特征性活性成分[10],[11],[12]。多项研究表明连翘对AD具有益处[13],[14],[15]。我们的研究发现，连翘提取物中的叶成分能有效抑制神经炎症[14]，而连翘苷作为其主要成分，可通过下调乙酰胆碱酯酶和上调2-花生四烯酰甘油来发挥神经保护作用[15],[16]。

网络药理学是一种跨学科技术，结合了系统生物学、计算生物学和网络生物学，通过分析复杂的生物网络来预测药物的作用机制[17],[18]。分子对接可用于预测化合物与蛋白质之间的结合模式和亲和力，在药物筛选中得到广泛应用[19]。分子动力学模拟可以研究分子结构和动态，揭示分子相互作用的机制，通过分析模拟轨迹和相互作用模式为药物疗效和安全性提供宝贵见解[20]。光谱学也是研究分子相互作用（尤其是小分子化合物与蛋白质之间的相互作用）的强大工具。这些技术共同为蛋白质-配体相互作用提供了全面的理解，有助于药物设计和分析。迄今为止，这些技术已成功用于阐明天然产物在多种疾病中的多靶点作用[21],[22]。

因此，在本研究中，我们运用了网络药理学、分子对接和光谱学技术来预测、分析和验证连翘干预AD的成分、关键靶点和作用途径。

材料与溶液制备

木犀草素、槲皮素、吴茱萸素、马来林、奥莱酸、β-谷甾醇、山柰酚、ビククリン、菲利林和菲利根宁的纯度均≥98%，购自Must Bio-Technology（中国成都）。ATP、蛋白激酶B（AKT1，来自昆虫细胞）和Kinase-Glo Plus分别购自Aladdin（中国上海）、Carna Biosciences（日本神户）和Promega（美国麦迪逊）。Crosstide和SC79（AKT1激动剂）购自MedChem Express（美国新泽西）。其他所有试剂均来自相应供应商。

连翘中化合物的筛选

首先，选择了11种满足DL≥0.18和OB≥30%标准的化合物作为候选化合物，其详细信息见图1和表S1。

吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）参数在现代药物发现过程中起着关键作用，有助于识别具有优化药代动力学特性的化合物。表S2中的ADMET分析结果显示，这11种潜在化合物均无细胞毒性。

结论

本研究利用网络药理学和分子对接技术筛选了连翘及其在AD中的化合物、靶点和作用途径。AKT1被确定为AD的潜在中心靶点，11种化合物被认为是可能干预AD的连翘成分。酶活性检测证实，木犀草素、菲利林和ビククリ林能够增强AKT1的活性。分子对接实验还表明，这三种化合物与AKT1的同一区域结合，激活了AKT1并促进了其活性。

作者贡献声明

林从焕：撰写初稿、方法学设计、数据整理。任艳：数据整理、方法学设计、审稿与编辑。张立伟：项目指导、方法学设计、实验实施、概念构思。杜慧智：撰写与编辑、项目管理、方法学设计、实验实施、资金获取、概念构思。

伦理批准声明

不适用。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了山西省基础研究计划（编号202303021211015）的支持。