从日本石松（Lycopodium japonicum）中提取出的三对引人入胜的三萜类化合物对映体

《Journal of Molecular Structure》：Three pairs of intriguing triterpenoid enantiomers from Lycopodium japonicum

从日本石松中分离出三对三萜类手性异构体及两种生物合成相关化合物，通过X射线晶体分析和Mosher酯法确定绝对构型，发现其生物活性与立体构象相关，分子模拟显示构象差异影响乙酰胆碱酯酶抑制活性及细胞毒性。

　　

郑婷|李贤迪|向俊宇|秦琪|朱正天|程家豪|张欣|杨静|陈红杰|康文远|周学明

教育部热带药用资源化学重点实验室，海南师范大学，中国海南省海口市，571158

摘要

从日本蕨（Lycopodium japonicum）Thunb. 中分离出了三对有趣的三萜类对映体，分别为(-)-onocerin（1）、(+)-onocerin（2）、(-)-onocerin A（3）、(+)-onocerin A（4）、(-)-onocerin B（5）、(+)-onocerin B（6），以及两种生物化学相关的三萜类化合物：3β,21α-二羟基-serrat-14-烯-16-酮（7）和serrat-14-烯-3β,21α-二醇（8）。新化合物1和已知化合物2是一对三萜类对映体，其绝对构型通过X射线晶体学分析确定。化合物3/4和5/6代表另一对新三萜类对映体，其绝对构型通过Mosher酯法确定。这项工作提供了重要的新见解，据我们所知，这是首次在日本蕨属植物中鉴定出三萜类对映体。化合物1-8的乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制活性以及对四种人类癌细胞系的细胞毒性活性进行了评估。化合物1、3和5表现出显著的AChE抑制作用，其IC50值分别低于其对映体10倍以上，分别为2.35 ± 0.22、3.21 ± 0.12和3.62 ± 0.10 μM。化合物7对四种癌细胞系（HeLa、MCF-7、A549和MGC-803）表现出强活性，IC50值为1.86-36.74 μM。化合物1-6的分子对接和分子动力学（MD）模拟表明，观察到的生物活性差异源于构象变化。这些构象差异导致对映体进入AChE活性位点的能力不同。

引言

日本蕨（Lycopodium japonicum）Thunb（鳞毛蕨科）在中国俗称“神金草”，是一种原产于热带山区的多年生蕨类植物[1]。它也广泛分布于南半球和北半球的北部森林[2]。在传统中医实践中，由于其显著的药用特性（包括舒筋、活血、祛风和通经络的作用），日本蕨已被临床使用了几个世纪。它被用于治疗多种疾病，如风湿性关节炎、肌肉痉挛、肢体麻木和血瘀引起的疼痛，其疗效已通过长期临床实践和现代药理学研究得到验证[3,4]。在这种植物中的两种主要生物活性成分（生物碱和三萜类）中，过去几十年主要研究了生物碱，其中蛇麻素A（huperzine A）是典型的代表[5,6]。蛇麻素A是一种强效的乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂，自1996年以来在中国被批准用于治疗轻度至中度阿尔茨海默病，并因其高效性和低毒性而在神经药理学领域引起了广泛关注[7]。相比之下，尽管三萜类化合物具有潜在的生物价值，但对日本蕨中的三萜类化合物的研究仍然相对较少。植物化学研究表明，日本蕨属中的三萜类主要是serratene型三萜类及其生物合成前体α-onocerin的衍生物[8, [9], [10]，这些化合物被视为日本蕨属的化学分类标志物，将其与其他鳞毛蕨科属区分开来。

serratene型三萜类的分子结构非常独特，与其他类型的三萜类不同。具体来说，它们的碳骨架由四个六元环（标记为A、B、D和E）和一个不寻常的七元环C组成，形成了一个罕见的五环三萜框架[11]。这个特殊的七元环C是由碳骨架中的C-8和C-27原子环化并连接而成的，这是serratene型三萜类独特化学性质和生物活性的关键结构特征。相比之下，其生物合成前体α-onocerin的衍生物仅具有四个六元环A、B、D和E，C-8和C-27原子未连接，因此无法形成特征性的七元环C[12]。serratene型三萜类与其前体衍生物之间的这种结构差异直接导致它们的物理和化学性质以及生物活性的显著差异——但由于缺乏深入研究，这些活性的具体调控机制尚未完全阐明。

尽管对日本蕨中的三萜类化合物的研究有限，但现有的现代药理学研究表明，serratene型三萜类及其生物合成前体的衍生物表现出多种显著的生物活性，包括强效的乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制作用、抗肿瘤作用和DNA拓扑异构酶II抑制作用[13, [14], [15]]。鉴于日本蕨中的三萜类化合物具有显著的生物活性、低毒性和天然来源，再加上目前对其研究的不足，这些化合物近年来引起了制药研究人员的越来越多的关注。它们被认为是开发新型AChE抑制剂（补充蛇麻素A）和治疗阿尔茨海默病及具有高疗效和低副作用的抗肿瘤药物的潜在先导化合物。然而，目前对这些三萜类的研究仍然远远不够：它们的具体结构-活性关系（SARs）、作用机制和体内药代动力学特性仍不清楚，这严重阻碍了它们的进一步开发和应用。因此，对日本蕨中的serratene型三萜类及其前体衍生物进行深入研究，对于探索新的药用资源、补充生物碱研究以及开发创新药物具有重要意义。

我们对日本蕨中新型活性serratane型三萜类的寻找导致了三对有趣的三萜类对映体（1-6）以及两种生物化学相关的三萜类化合物（7和8）的分离。五种新三萜类化合物（1和3-6）的绝对构型通过单晶X射线衍射分析和Mosher酯法确定。新的对映体对（1/2、3/4和5/6）是在日本蕨属植物中首次发现的。我们对它们的抗AChE活性进行了评估，发现每对化合物都有不同的活性。此外，所有化合物（1-8）都对四种人类癌细胞系的细胞毒性进行了评估。

实验程序

一般实验程序

NMR光谱在JEOL JEM-ECP NMR光谱仪上以600 MHz采集¹H和150 MHz采集¹³C。HRESIMS光谱在Q-TOF Global GAA076 LC质谱仪上记录。红外光谱在Nicolet 6700光谱仪上测量。X射线衍射数据在Agilent Technologies Gemini A Ultra系统上获得。半制备HPLC分离使用Agilent Eclipse XDB-C₁₈柱（9.4 × 250 mm，5 μm）和ULTRON ES-OVM柱（150 × 10 mm，5 μm）。此外，还使用了BUCHI Medium-Pressure...

结构鉴定

从HRESIMS数据（m/z 441.3735 for onocerin [M - H]；calcd 441.3738）中获得onocerin（对映体混合物1/2），分子式为C₃₀H₅₀O₂。onocerin的¹H和¹³C NMR光谱与已知化合物(+)-onocerin（2）相同。同时，我们还分析了onocerin的2D NMR数据（HSQC、HMBC、¹H-¹H COSY和NOESY；图2），结果与(+)-onocerin（2）的结构完全一致。

结论

对日本蕨的这项植物化学研究分离并鉴定出了三对新的三萜类对映体（1/2、3/4和5/6）以及两种已知类似物（7和8）。通过全面的光谱分析、单晶X射线衍射和化学方法，明确地阐明了它们的结构，包括绝对构型。值得注意的是，化合物1-6是首次在鳞毛蕨属中报道的三萜类对映体。

致谢

本研究得到了海南省自然科学基金（225RC752）和海南省“南海新星”科技创新人才项目（NHXXRCXM202315）的支持。

CRediT作者贡献声明

郑婷：撰写——初稿，数据管理。 李贤迪：撰写——初稿，数据管理。 向俊宇：研究，概念化。 秦琪：研究，数据管理。 朱正天：研究。 程家豪：数据管理。 张欣：研究。 杨静：数据管理。 陈红杰：研究，数据管理。 康文远：撰写——审稿与编辑，软件，方法学，数据管理，概念化。 周学明：撰写——审稿与编辑。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。