《HemaSphere》：Deep cytomorphology identifies erythroid skewing and monocytic morphology to predict TKI sensitivity in CML patients
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本研究通过深度学习分析骨髓涂片，首次发现红系前体富集、单核细胞核分叶增加与较低的诊断外周血白细胞计数可作为预测慢性粒细胞白血病(CML)患者对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗敏感性的新型形态学生物标志物。研究者构建了整合影像学与临床变量的"Morphoclinical"模型，其预测效能(AUROC 0.76)显著优于传统EUTOS长期生存(ELTS)评分(AUROC 0.53)，为优化CML一线治疗选择提供了创新且可及的病理学工具。
引言：优化慢性粒细胞白血病治疗决策的未竟需求
慢性粒细胞白血病(CML)是一种以存在费城染色体及BCR::ABL1融合基因为特征的血液系统恶性肿瘤。靶向BCR::ABL1激酶的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的问世彻底改变了CML的治疗格局，使其从致死性疾病转变为多数患者可管理的慢性病。目前，包括伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼和博舒替尼在内的多种TKI被批准用于一线治疗。其中，第一代TKI伊马替尼因其经济性，在慢性期(CP) CML患者的初始治疗中仍被广泛使用。然而，第二代TKI(2GTKIs)如达沙替尼、尼洛替尼等能更快、更频繁地诱导深度分子学缓解，这为日后实现无治疗缓解(TFR)提供了可能，从而提高患者生活质量并减少终身治疗的需要。
目前，CML的一线治疗选择主要依据诊断时的预后风险，特别是欧洲治疗与预后研究长期生存(ELTS)评分。尽管ELTS评分能识别高进展风险患者，但仍有70%的CML相关死亡发生在低至中危患者中，这凸显了寻找更精准治疗生物标志物的迫切性。此外，ELTS评分旨在预测预后而非TKI敏感性。作为一种廉价且常规的评估资源，CML诊断中的骨髓(BM)细胞组成、成熟度和形态学尚未与治疗反应充分关联研究。本研究假设，BM细胞形态学特征可以补充ELTS评分，辅助2GTKI选择，提高深度分子学缓解率及实现TFR的可能性。为此，研究者利用基于深度学习的图像分析技术，系统研究了CML患者细胞形态学的临床意义。
方法：多中心队列与深度学习驱动的细胞形态定量分析
本研究纳出来自七个临床中心的598名独特患者，共计分析了1548张May-Grünwald Giemsa (MGG)染色的骨髓穿刺涂片。根据疾病阶段和切片可用性，数据集被分为三个队列：用于研究CML患者和多时间点BM细胞组成的“完整队列”，用于构建、验证和评估多参数模型的“建模队列”，以及用于通过人工显微镜检查验证计算生物学发现的“细胞分类计数队列”。
所有MGG染色切片均被数字化。研究使用专为细胞形态学切片扫描设计的成像系统，首先获取10×放大倍率的全景图像，然后手动标注有代表性的感兴趣区域，并在100×油镜放大倍率下扫描。图像分析通过Cellbytes应用程序完成，该软件基于卷积神经网络或基于Transformer的网络，形成了一个全面的BM细胞组成及相关形态学图谱。分析流程包括样本分割、细胞检测、细胞分类（分为17个不同类别）以及细胞、细胞核和细胞质水平的形态计量学量化（如大小、圆形度、颜色等）。为减少技术伪影，研究者训练了多种算法以排除过度焦外区域、技术性固缩细胞及因机械压迫等原因造成的低质量细胞。
结果：发现预测TKI敏感性的新型细胞形态学生物标志物
患者特征与骨髓细胞组成异质性
建模队列和细胞分类计数队列的人口统计学和临床特征基本可比。通过分析BM细胞比例与血细胞计数的相关性，研究者发现BM和PB是两个不同的细胞区室。利用细胞比例对BM细胞形态学进行UMAP降维可视化显示，样本主要根据疾病阶段及其相关的外周血白细胞(PB WBC)计数发生分离，急变期CML样本与慢性期CML样本形成明显不同的簇。在仅关注治疗前的CP-CML样本时，其以中性粒细胞、晚幼粒细胞和中幼粒细胞为主，但相当一部分样本也富含幼红细胞，暗示了从早期髓系祖细胞和干细胞存在不同的谱系定向模式，突显了造血成熟和谱系间的异质性。
WBC计数、红系偏移和单核细胞形态预测MMR概率
为识别与主要分子学缓解(MMR)相关的关键临床和细胞形态学特征，研究者在建模队列的训练数据集中对近950个计算衍生的形态学变量进行了单变量Cox回归分析。结果显示，较高的PB WBC计数、脾脏大小和ELTS评分与较低的MMR可能性相关。在BM细胞类型中，较高的原红细胞比例和未成熟红系细胞（原红细胞与幼红细胞之和）比例预示着更高的MMR率。高比例的原红细胞和低PB WBC也与更深度的缓解(MR4.0)相关。这些关联在独立的细胞分类计数队列中得到了验证，该队列中BM红系前体细胞由经验丰富的细胞形态学家通过数字显微镜进行了视觉确认。
研究还发现多个髓系细胞的BM细胞形态学特征可以预测TKI敏感性。例如，巨核细胞圆度和较大的原始细胞大小与较低的MMR率相关，而较高的单核细胞大小、细胞核大小和细胞核周长则有利于更高的MMR率。由于单核细胞特征间存在高度共线性，研究者选择关注单核细胞核周长，该特征在整个建模队列中仍然具有预测性。单细胞图像显示，较低的细胞核周长似乎反映了较小的细胞核大小和较少的分叶，可能表明单核细胞成熟状态的改变。
BM细胞形态学与临床特征的部分关联
新发现的生物标志物与患者年龄或性别无关。然而，较高的PB WBC计数与较高的ELTS评分、PB原始细胞比例、脾脏肿大以及随之而来的更高一线2GTKI使用率相关。相反，较高的PB淋巴细胞比例与较低的PB WBC计数相关。在形态学方面，较高的PB WBC计数与较低的原红细胞比例和涂片周边的脂滴浓度相关。低BM原红细胞比例则与较大的脾脏大小和较高的PB嗜碱性粒细胞计数相关。Spearman相关性分析进一步表明，高WBC与较低的粒细胞、淋巴细胞和单核细胞计数相关，并与左移和向粒细胞以外的髓系谱系偏移有关。这些发现提示，PB WBC计数不仅反映了较高的疾病负荷，还可能促使幼红细胞从BM移位到PB，导致其循环水平升高。
构建优于传统评分的多参数“Morphoclinical”模型
为研究临床和细胞形态学变量的协同作用，研究者开发了一个预测TKI敏感性的多参数Cox回归模型。最终的“Morphoclinical”评分模型包含五个具有统计学意义的特征：BM原红细胞比例和单核细胞核周长中位数增加MMR概率，而PB WBC计数、一线使用伊马替尼和高危ELTS评分则降低MMR概率。留一特征分析显示，所有特征都对模型的预测能力有贡献，其中排除PB WBC计数导致模型性能下降最大。
根据模型评分将患者分为低危和高危组后，在内部测试集中，高分组的患者在24个月时MMR累积发生率达到100%，而低分组仅为60%。该模型在训练集和外部测试集中也表现一致。与当前指导2GTKI选择的临床指南——ELTS高危组相比，Morphoclinical模型在24个月时的受试者工作特征曲线下面积(AUROC 0.76)和精确率-召回率曲线下面积(PRAUC)均显著优于ELTS高危组(AUROC 0.53)和BCR::ABL1半衰期(AUROC 0.61)。
2GTKIs可抵消低Morphoclinical评分相关的不良反应
研究者进一步探讨了Morphoclinical评分在不同治疗组中的效用。无论是一线伊马替尼还是2GTKI治疗组，高Morphoclinical评分均提高了实现MMR的概率和速度。值得注意的是，对具有不利Morphoclinical评分的患者使用2GTKI，能将其达到MMR的可能性提高到与具有更有利评分且使用伊马替尼治疗患者相当的水平。这提示2GTKI可以克服由形态学特征提示的不良预后。
单核细胞核周长可区分高危患者与对照
与636名年龄和性别匹配的无活动性血液疾病的对照个体相比，CML患者的单核细胞核周长值存在显著差异。根据中位数值将患者分为两组后，周长较低组的分布与对照组相似，而周长较高组则明显偏离对照组。这表明单核细胞核形态的改变是CML疾病状态的特征之一。
讨论：细胞形态学为CML精准治疗开启新视角
这项多中心研究证实，整合常规预后因素、PB WBC和新型细胞形态学特征的简单Morphoclinical模型，有助于识别可能从一线2GTKIs中获益的患者。尽管研究纳入了来自不同中心、存在样本制备和染色技术差异的样本，但基于深度学习的图像分析始终能识别出具有生物学意义的细胞形态学特征，强调了其广泛应用的潜力。
研究发现的预测性特征暗示了可能影响TKI敏感性的细胞谱系选择过程。红系前体富集与更好的TKI反应相关，其机制尚不完全清楚，可能与其它髓系基因突变或BM微环境变异有关。未来研究需要探索是否可以通过药理干预增加红系定向，以及这是否会改善TKI敏感性。同时，单核细胞核分叶的增加与更好的治疗结果相关，可能反映了单核细胞的成熟状态，但其与TKI疗效之间的因果关系需进一步阐明。
与既往研究一致，本研究发现较高的诊断时WBC计数与较差的治疗反应显著相关。研究者建议，基线WBC≥50×109/L的患者应强烈考虑使用伊马替尼作为一线TKI。高WBC可能反映了更大的白血病干细胞负荷，或与CML病程更长、其它髓系驱动基因突变有关。
本研究也存在一些局限性。例如，由于CML诊断通常直接，基因测序并非临床必需，因此未能将形态学特征与突变数据关联。其次，Morphoclinical模型的计算依赖于高质量的BM成像和数字分析，这在当前常规临床实践中尚未标准化。最后，在研究设计中，一线TKI代别被作为协变量纳入，这限制了模型旨在指导初始TKI选择的前瞻性适用性，需要进一步验证。
总之，这是首个利用计算分析CML骨髓细胞形态学来预测TKI反应的研究。该研究强调了数字细胞形态学分析在优化CML一线TKI治疗选择、提高停药成功率方面的潜力，有望最终改善CML患者的长期管理、成本效益和生活质量。研究结果强化了BM微环境在理解CML病理生物学中的核心地位，成像等新方法能够揭示被忽视的机制，甚至找到调节TKI敏感性的干预措施。
