《Aging Cell》：The HIF-1α Pathway Regulates Satellite Cell Fate During Aging Through Histone Lactylation
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本篇研究揭示，衰老伴随的肌肉减少症部分源于缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）信号减弱，导致糖酵解型肌肉纤维丢失和卫星细胞（SCs）功能衰退。研究者通过药物（FG-4592）重新激活HIF-1α，成功逆转了老年小鼠卫星细胞的代谢缺陷，上调糖酵解酶和乳酸转运蛋白，促进乳酸生成和组蛋白乳酰化，进而将细胞命运从衰老转向静止，最终增强了细胞的再生能力。这项研究为利用脯氨酰羟化酶抑制剂（如FG-4592）治疗肌肉衰老提供了新的机制见解和潜在策略。
2.1 骨骼肌和卫星细胞中HIF-1α通路随年龄增长而受抑制
为了确认研究模型中肌肉减少症与HIF-1α信号下降相关，研究团队首先在雄性C57BL/6J小鼠中建立了表型基线。与2月龄的年轻对照小鼠相比，18月龄的老年小鼠体重增加了1.33倍，附睾脂肪增加了2.77倍，而胫骨前肌（TA）质量则损失了27%。胫骨前肌提取物的免疫印迹分析显示，随着年龄增长，HIF-1α蛋白丰度下降了约46%，而HIF-2α水平保持不变。
接下来，研究人员从膈肌、股四头肌、胫骨前肌和腓肠肌中分离出卫星细胞（SCs）。流式细胞术分析证实，分选出的细胞群体中81.7%为CD106+，排除了其他非靶细胞类型的污染。对新鲜分离的SCs进行蛋白质组学分析显示，老年SCs中与脂肪变性及再生能力受损相关的代谢途径，如脂肪酸β-氧化、氧化磷酸化和脂肪分解通路得到富集。免疫印迹和定量PCR（qPCR）进一步证实，老年SCs中HIF-1α蛋白水平下降了48%，其经典靶基因血管内皮生长因子A（Vegfa）和脯氨酰羟化酶1（Egln1）的转录水平也分别下降了46%和62%。这些结果表明，骨骼肌组织和SCs均表现出HIF-1α信号随年龄增长而协调性下调。
2.2 HIF-1α的药理学再激活可恢复老年卫星细胞的糖酵解代谢
鉴于SCs的年龄相关代谢漂移与HIF-1α的丢失有关，研究者测试了急性稳定该因子是否能重置其代谢程序。年轻和年老SCs均用50 μM的脯氨酰羟化酶抑制剂FG-4592处理48小时。qPCR证实了代谢通路的激活，年轻和年老细胞中Vegfa和Egln1的表达分别大幅上调。蛋白质组学分析捕获了全局细胞反应。功能富集分析将上调的酶归因于糖酵解、糖原降解和跨质膜的乳酸输出，而下调的酶则与三羧酸（TCA）循环、电子传递链和支链氨基酸分解代谢相关。对单个酶的分析证实了代谢转换：己糖激酶1/2（Hk1/Hk2）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、果糖二磷酸醛缩酶A（ALDOA）和丙酮酸激酶M（PKM）增加了2到5倍，而乌头酸酶2（ACO2）、琥珀酸脱氢酶复合体黄素蛋白亚基A（SDHA）和柠檬酸合酶则显著下降。功能测试表明，年轻和老年SCs的葡萄糖摄取分别增加了3.41倍和1.96倍，Gapdh和Aldoa的mRNA表达也相应增加。这些结果证明，HIF-1α的药理性短暂增加足以恢复老年SCs中年轻化的糖酵解代谢特征。
2.3 老年卫星细胞中乳酸积累和组蛋白乳酰化的恢复
接下来，研究探讨了代谢重编程是否会导致乳酸产量增加以及随之而来的组蛋白乳酰化（一种在干细胞维持中发挥作用的表现遗传修饰）增强。蛋白质组学分析显示，乳酸脱氢酶A（Ldha）和乳酸输出蛋白单羧酸转运蛋白4（Slc16a3/MCT4）被强烈诱导，而乳酸输入蛋白单羧酸转运蛋白1（Slc16a1/MCT1）或乳酸脱氢酶B（LDHB）则保持不变。qPCR证实，年轻细胞中Slc16a3和Ldha的诱导分别增加了7.56倍和2.3倍，老年细胞中则分别增加了4.31倍和2.1倍。细胞内乳酸在老年SCs中增加了1.9倍，这提示可能涉及组蛋白乳酰化。
为了研究SCs衰老与乳酰化的关系，研究者使用乳酸脱氢酶A（LDHA）的化学抑制剂草氨酸钠（10 mM）处理SCs。蛋白质组学分析显示，单独使用草氨酸钠对年轻或老年SCs的谱图影响不大。而用草氨酸钠和FG-4592共同处理的SCs，其蛋白质组和代谢谱与单独使用FG-4592处理的结果有大量重叠，这表明草氨酸钠并未完全抵消FG-4592诱导的转录激活。使用泛乳酰化赖氨酸抗体的免疫印迹显示，与年轻SCs相比，老年SCs的基线组蛋白乳酰化水平较低（尽管差异不显著）。值得注意的是，FG-4592使老年细胞的信号增加了2.37倍，但对年轻细胞没有影响，表明存在天花板效应。有趣的是，同时用FG-4592和草氨酸钠处理的SCs显示乳酰化水平分别增加了1.5倍和1.75倍，这表明观察到的染色质修饰是由乳酸而非FG-4592的脱靶效应引起的。
2.4 乳酰化相关的细胞周期从衰老到静止的重编程
为了评估乳酰化增加是否影响细胞周期进程，卫星细胞在无血清培养基中同步化24小时，然后用FG-4592处理48小时，并用碘化丙啶染色。衰老使S期细胞比例减少了约15%，这与衰老相关的细胞周期减慢一致。FG-4592进一步使年轻和老年SCs的S期细胞比例分别减少了65%和60%，增加了G1/G0期阻滞。FG-4592和草氨酸钠联合处理导致两组细胞的S期细胞比例减少约79%，而单独使用草氨酸钠没有效果。蛋白质组学分析证实了这些数据，显示G1/S期进展所需的每个细胞周期蛋白-CDK复合物在治疗后均减少，最明显的是细胞周期蛋白E-CDK2和细胞周期蛋白A2-CDK1模块。qPCR也证实了这些变化。
为了区分静止和衰老，研究者检测了细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（Cdkn2a）和配对盒基因7（Pax7）。衰老使Cdkn2a转录本增加了2.43倍，p16Ink4a蛋白增加了1.76倍。FG-4592使老年SCs中的Cdkn2a和p16Ink4a分别降低了约67%和54%，恢复到了年轻水平。与此同时，HIF-1α激活后，Pax7的表达也得到改善。FG-4592处理后，年轻和老年SCs中Pax7的mRNA水平分别增加了1.80倍和1.79倍。免疫荧光证实，FG-4592处理后，年轻和老年细胞培养物中Pax7+细胞核的比例分别增加了1.46倍和1.83倍。这些结果表明，HIF-1α驱动的乳酰化使衰老的SCs从衰老状态转向静止状态，降低了p16Ink4a并恢复了Pax7的表达。
2.5 短暂的HIF-1α激活引发的持续糖酵解重编程增强肌源性分化
为了测试短暂的HIF-1α脉冲是否能带来持久益处，研究者先用FG-4592、草氨酸钠或两种药物预处理SCs 48小时，洗涤后在不含药物的分化培养基中培养4天。肌球蛋白重链免疫染色显示，融合指数没有变化，但分化指数（计算为每个融合核的肌管面积）在年轻培养物中增加了1.6倍，在老年培养物中增加了2倍，表明肌纤维变得更大。单独使用草氨酸钠不影响SCs分化，而联合处理使老年肌管的分化指数增加了1.8倍。原肌球蛋白-1（Tpm1）和原肌球蛋白-2（Tpm2）的表达证实了分化增强。衰老使Tpm1转录本减少了46%，但FG-4592使老年肌管中的表达恢复了2.41倍，达到与年轻对照相当的水平；联合处理则诱导了2.7倍的增加。
对肌管裂解液的液相色谱-质谱（LC–MS）分析显示，二甲基亚砜（DMSO）对照组培养的肌管表现出与年龄相关的缺氧反应、收缩装置和线粒体代谢的下调。相反，来自FG-4592预处理的SCs的肌管，其HIF反应性糖酵解酶持续高表达，而氧化磷酸化组分表达较低。来自联合处理的SCs的肌管中，糖酵解通路也保持上调。老年肌管还显示出胰岛素样生长因子-1（IGF-1）和磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K–Akt–mTOR）信号通路的增强，两者都是促进肥大的驱动因子。
为了确认代谢通路的改变在分化过程中持续存在，研究者评估了选定代谢蛋白的变化。具体来说，在静息期，经FG-4592处理和联合处理的细胞中，腺苷三磷酸（ATP）水平均有所下降，但在分化过程中得到了恢复。老年肌管在FG-4592或联合处理后，ATP增加了1.34倍和1.53倍。同样，葡萄糖摄取和GapdhmRNA在老年肌管中显示出最显著的变化。葡萄糖摄取在来自两种处理的老年肌管中均增加了1.72倍。Gapdh表达水平也呈现出相同趋势，来自FG-4592单独处理或联合处理的老年肌管中分别增加了1.58倍和1.95倍。
FG-4592的抗萎缩效应得到进一步支持：Igf-1水平在FG-4592或联合处理后，老年肌管中分别增加了1.54倍和1.51倍。相应地，萎缩的标志物基因三结构域蛋白63（Trim63）的表达呈下降趋势。亲代SCs中较低的p16Ink4a水平与这些分化收益相关。因此，短暂的HIF-1α刺激建立了一种代谢和表观遗传记忆，即使在撤药后，也能维持糖酵解、激活促生长信号，并产生更大、功能更优的肌管。
3 讨论
低氧张力是干细胞微环境的一个决定性特征，对于保持自我更新和再生能力至关重要。在骨骼肌中，微血管氧分压在糖酵解型快收缩肌纤维中天然较低。这种生理梯度解释了先前报道的快肌中HIF-1α浓度较高的原因，并强调了HIF-1α在维持II型纤维形态和代谢中的核心作用。本研究的数据将这些观察扩展到衰老过程，显示在胫骨前肌和新鲜分离的SCs中，HIF-1α蛋白及其经典靶基因发生协调性下降。
与这些发现一致，我们的蛋白质组学分析显示，老年SCs上调了脂肪酸β-氧化和氧化磷酸化，而牺牲了糖酵解，这些代谢程序与快速激活和增殖不相容。用临床批准的脯氨酰羟化酶抑制剂FG-4592药物性重新稳定HIF-1α，恢复了年轻和老年卫星细胞的糖酵解。非靶向蛋白质组学显示，所有检测到的限速糖酵解酶增加了2至5倍，同时伴随着三羧酸循环和电子传递链蛋白的抑制。功能测定证实葡萄糖摄取增加了3至2倍，并且完全逆转了与年龄相关的丙酮酸脱氢酶（PDH）-丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）失衡，表明代谢重编程不仅限于蛋白质丰度，还导致了真正的通量变化。
本研究的一个重要进展是证明了糖酵解能力的恢复导致了细胞内乳酸的平行增加，并且关键性地恢复了老年SCs中的组蛋白乳酰化。增加的组蛋白乳酰化似乎介导了SCs的命运转变，因为它与细胞周期蛋白-CDK表达的减少、S期细胞比例的降低、p16Ink4a水平的下降以及Pax7转录本和Pax7阳性细胞核的增加同时发生。这些特征表明细胞从不可逆的衰老转变为可逆的静止，保留了长期的干细胞潜能。
即使在停药后，这种益处仍然持续。暴露于FG-4592 48小时脉冲的SCs产生的肌管几乎增大了一倍，含有更多的ATP，并表达更多的原肌球蛋白-1/2。对这些肌管的蛋白质组学分析显示，糖酵解以及PI3K–Akt–mTOR信号通路持续激活，而氧化磷酸化受到抑制。Igf-1的上调和Trim63的部分下调进一步强调了向合成代谢的转变。这些分子变化带来了可测量的功能益处，并且分化指数改善而融合指数不变，表明肥大是通过增加单个纤维的大小实现的，而不是简单地增加融合事件。这种融合能力的保持特别有吸引力，因为过度的融合可能在体内耗尽卫星细胞库。
3.1 结论
我们的研究确定了HIF-1α–乳酸–组蛋白乳酰化轴是调控卫星细胞衰老的关键且可药物干预的通路。我们证明，使用脯氨酰羟化酶抑制剂FG-4592进行短暂且临床可行的脉冲式治疗，可以通过恢复老年卫星细胞的糖酵解代谢、重置其表观遗传景观以及恢复其再生能力，有效地实现细胞年轻化。至关重要的是，这种短暂的干预留下了持久的促肥大记忆，增强了随后的肌源性分化。这些结果为研究间歇性给予FG-4592（无论是单独使用还是与抗阻训练结合）作为一种有前景的治疗策略，以对抗肌肉减少症和其他肌肉消耗性疾病，提供了令人信服的机制依据。
