《Environmental DNA》：A Comparison of DNA Metabarcoding Cloacal Swabs and Stomach Contents for Shark Diet Reconstruction
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本文評述了通過DNA宏條碼（DNA metabarcoding）技術，比較傳統胃內容物分析法與新型泄殖腔拭子採樣法在重建鯊魚食性上的表現。研究證實，這種非致死性、微侵入性方法能提供與胃內容物分析相當的物種豐富度與多樣性，且具有更高的分類學分辨率，為受保護、稀有物種的食性研究提供了有效的替代方案，對海洋生態學研究與鯊魚保育具有重要意義。
1 引言
海洋頂級捕食者的食性長期以來難以精確研究，這主要歸因於直接觀察捕食事件的困難性，以及傳統食性重建方法（例如胃內容物的形態學鑑定）分類學分辨率低。傳統的胃內容物分析通常需要進行致死性的解剖或使用胃灌洗法，但胃灌洗法在鯊魚研究中的應用極少，且對其侵入性操作後野生鯊魚的恢復和存活率研究不足。因此，對於受保護、稀有或長壽物種而言，形態學胃內容物分析既難以實施也存在倫理問題，且往往不精確——即缺乏分類學分辨率。從部分消化的胃內容物中鑑定獵物物種非常困難，常導致大量殘骸無法鑑定或只能歸類到更高級別的分類群（如“硬骨魚類”）。此外，傳統形態學分析可能低估缺乏耐消化身體部位（如殼和骨骼）的軟體生物，且許多研究，尤其是針對鯊魚的研究，常發現大量樣本的胃是空的，導致無效的致死性採樣。營養標記物（如穩定同位素和脂肪酸）分析也常用於評估捕食者食性，但該方法缺乏識別特定獵物物種所需的分類學分辨率。
DNA宏條碼技術在食性重建中的應用日益普遍，它允許在單一樣品中同時鑑定多個分類單元。陸地和海洋系統的研究均已使用胃內容物和糞便的宏條碼來描述捕食者食性。糞便通常可以以相對非侵入性的方式（如泄殖腔拭子）收集，甚至無需捕捉動物。此前一項創新研究通過對圈養檸檬鯊的受控餵養試驗表明，使用泄殖腔拭子收集鯊魚糞便並對糞便DNA進行宏條碼分析，可成功用於鯊魚食性重建。然而在自然環境中，由於獵物DNA在通過腸道過程中的降解，糞便樣本可能導致對捕食者食性的描述不完整。消化過程中，若獵物DNA降解成過小的片段，將無法在PCR中被擴增並通過宏條碼檢測到，從而可能導致食性重建不完整。此外，糞便中可檢測到的DNA量可能因獵物組織類型而異。
很少有研究測量消化如何影響獵物DNA檢測，且尚未在鯊魚中進行此類研究。一些研究在比較魚類的胃內容物時發現，高度降解的胃內容物顯示出較低的獵物物種豐富度。相反，另一項研究比較了海濱麻雀的胃內容物和糞便樣本，發現兩種樣本類型在分類學豐富度和多樣性上具有相似性，並得出結論認為樣本類型不影響食性描述。
鯊魚在海洋生態系統中扮演著不可或缺的角色，然而對於許多物種，包括食性在內的基本生物學信息仍然有限。本研究的目的是進一步測試使用泄殖腔拭子和宏條碼糞便DNA進行鯊魚食性重建的可行性。為此，我們對四種不同鯊魚進行採樣，通過對來自同一隻鯊魚的胃內容物DNA和泄殖腔拭子收集的糞便DNA進行宏條碼分析，比較上、下消化道中獵物DNA的結果。我們還對這些鯊魚的胃內容物進行了形態學鑑定，並將其結果與胃內容物DNA和糞便DNA的結果進行比較。我們假設：（1）由於胃內容物消化程度較低、降解較少，胃內容物DNA將比糞便DNA產生更多可擴增的獵物DNA；（2）兩種樣本類型將提供相似的分類學豐富度和組成度量，因此樣本類型不會影響食性描述。
2 方法
2.1 鯊魚捕獲
研究捕獲了四種鯊魚：窄頭雙髻鯊（bonnethead，Sphyrna tiburo）、黑吻真鯊（blacknose，Carcharhinus acronotus）、黑梢真鯊（blacktip，C. limbatus）和大西洋尖吻鯊（Atlantic sharpnose，Rhizoprionodon terraenovae）。捕撈主要在鹽沼-牡蠣-海草複合體主導的淺海水域進行。大多數用於本研究的鯊魚是長期鯊魚調查項目中的偶然死亡個體。
2.2 糞便DNA收集
我們採用改進的泄殖腔拭子採集方案。所有泄殖腔拭子均在鯊魚從水中取出後立即在現場採集。先用浸泡了99.5%乙醇的擦拭布擦乾泄殖腔外部多餘的海水，然後將無菌棉籤插入泄殖腔約2.5釐米，旋轉約10秒。取出後，將拭子頭放入無菌小瓶，並立即置於冰上冷卻。返回實驗室後，樣本在-80°C下儲存約6個月。
2.3 胃內容物DNA收集
返回實驗室後，立即切除每條鯊魚的胃並冷凍儲存。在隨後進行胃內容物解剖時，使用兩層篩網（1毫米和250微米）分離胃內容物。被困在250微米篩網中的胃內容物懸液（即胃內容物漿液）被保留作為胃內容物DNA樣本，並儲存在-80°C下。
2.4 糞便DNA和胃內容物DNA提取
拭子上的糞便DNA使用DNeasy Blood and Tissue Kit提取。胃內容物漿液使用DNeasy PowerSoil Kit提取。每個胃都進行了兩次獨立的提取，以獲得重複樣本。所有DNA均洗脫至100 μL並在-20°C下保存。
2.5 宏條碼實驗室流程
我們擴增了線粒體12S rRNA基因的MiFish-U區域和線粒體rRNA基因的Crustacean_16S區域，因為目標鯊魚的食性主要由硬骨魚類和甲殼類組成。引物5'端添加了Illumina Nextera風格的接頭和異質性間隔序列以增加流動池序列多樣性。所有PCR反應均進行三次重複。合併並純化PCR產物后，進行第二步PCR以添加索引。最終的等摩爾文庫池進行了MiSeq雙端測序。
2.6 生物信息學分析
使用Cutadapt和Trimmomatic處理序列，並在Obitools3中進行分析。使用最低共同祖先算法進行分類學分配。使用LULU和MetabaRR包進行進一步過濾，以去除推定汙染物和低質量序列。讀數被標準化為中位數測序深度並轉換為每個樣本中的出現百分比。所有代碼均在GitHub上公開。
2.7 統計分析
我們僅分析了成功通過質量控制步驟的成對樣本（n=23）。使用Levene檢驗和配對t檢驗比較糞便DNA和胃內容物DNA之間的擴增子序列變體讀數數量。使用vegan包計算基於樣本的獵物稀疏曲線。使用方差分析比較兩種樣本類型之間的香農-威納多樣性指數和豐富度。使用phyloseq包計算每隻鯊魚成對樣本之間的索倫森相似性指數。使用非度量多維標度圖和置換多元方差分析比較不同鯊魚物種間兩種樣本類型的食性組成差異。我們在分析中考慮了相對讀數豐度和出現百分比。
3 結果
總共捕獲了48條鯊魚，其中28條有胃內容物。我們成功獲得了23條鯊魚的成對糞便DNA和胃內容物DNA樣本：10條窄頭雙髻鯊、4條黑吻真鯊、4條黑梢真鯊和5條大西洋尖吻鯊。在23個成功進行宏條碼分析的成對樣本中，21個胃有可形態學鑑定的獵物。
3.1 獵物鑑定
在泄殖腔拭子中，總共鑑定出19個獵物分類單元，其中74%鑑定到種，所有均鑑定到屬和科。窄頭雙髻鯊有三個獵物物種和一個屬僅在泄殖腔拭子中檢測到。黑梢真鯊也有三個獵物物種和一個屬僅見於泄殖腔拭子結果。大西洋尖吻鯊有一個獵物物種僅見於泄殖腔拭子，而黑吻真鯊沒有僅見於泄殖腔拭子的獵物。
在胃內容物漿液中，總共鑑定出25個獵物分類單元，其中80%鑑定到種，所有均鑑定到屬和科。各鯊魚物種均有僅在胃內容物漿液中發現的獨特獵物物種或屬。
3.2 形態學鑑定
在48個鯊魚胃中，28個（58%）含有可形態學鑑定的獵物。總共從21個胃中收集到81個獵物個體，平均每個胃發現兩個獵物個體。形態學鑑定中，32%的獵物個體被歸類為無法鑑定的硬骨魚、蟹類或獵物，僅有五個分類單元可以鑑定到種。
3.3 樣本比較
成對樣本共產生了1,396,719條擴增子序列變體讀數。泄殖腔拭子每個樣本的擴增子序列變體讀數比胃內容物漿液少28%，但兩種樣本類型的讀數變異程度相同。儘管胃內容物漿液鑑定出的分類單元更多（即物種豐富度更高），但在考慮鯊魚物種影響的情況下，兩種樣本類型在屬或種水平上檢測到的豐富度沒有統計學顯著差異。兩種樣本類型之間檢測到的多樣性（基於讀數數量）也沒有統計學顯著差異。所有物種的獵物稀疏曲線均未達到平臺期，表明分類單元豐富度可能被低估。
3.4 相似性與組成分析
從同一只個體收集的泄殖腔拭子和胃內容物漿液樣本測量的獵物組成相似度，範圍從完全重疊到完全不重疊。基於詹森-香農距離的非度量多維標度圖顯示，在比較兩種樣本類型（即糞便DNA和胃內容物DNA）的獵物組成時，沒有統計學差異。然而，獵物組成在四種鯊魚物種之間存在顯著差異。
4 討論
我們的結果表明，泄殖腔拭子的DNA宏條碼分析能夠代表鯊魚的胃內容物，是評估鯊魚食性的有效工具。正如我們預測的那樣，胃內容物漿液產生了顯著更多的擴增子序列變體讀數，表明腸道中發生了一些DNA降解。然而，分類學豐富度和組成沒有差異，這表明獵物DNA降解並不嚴重，不足以影響食性重建。
我們的研究結果與之前對海濱麻雀的研究相似。儘管豐富度和組成沒有顯著差異，但我們並不預期也不會發現從同一只個體採集的胃內容物和泄殖腔拭子估計的獵物組成完全相同。這兩種樣本類型是同時採集的，因此可能代表了不同的攝食事件，這可能是由於獵物DNA通過消化系統所需的時間造成的。因此，我們發現了僅存在於胃內容物漿液和僅存在於泄殖腔拭子中的屬。鯊魚是間歇性進食的，與肉食性硬骨魚相比消化速度較慢。殘留的DNA也可能在腸道和泄殖腔中存留時間超過胃排空和排洩期。因此，我們的採樣很可能捕捉到了每條鯊魚的多次近期覓食事件。獵物稀疏曲線也表明，所有物種的樣本量均未充分捕捉到其食性的完整豐富度。
窄頭雙髻鯊的食性更加特化（主要以大西洋藍蟹為食），因此胃內容物DNA中的餐食與糞便DNA中的前一餐由相同物種組成的機會更大。相比之下，大西洋尖吻鯊、黑梢真鯊和黑吻真鯊是更泛化的捕食者，因此同一只個體的兩種樣本類型之間的分類學組成差異更大。這表明，樣本類型之間分類學組成的變異更可能是由於採集時間點不同以及無法區分特定覓食事件（即餐次）所致，而非兩種採樣技術之間的差異。
許多鯊魚食性研究依賴於形態學胃內容物鑑定，並受限于大量空胃的發現。我們的結果顯示，泄殖腔拭子在產出食性數據方面成功率更高，並且即使在胃為空的情況下也能評估食性。
我們樣本中測序的魚類和甲殼類物種僅佔該地區存在物種的一小部分，這表明泄殖腔拭子上如果存在環境DNA汙染，其程度也很輕微。此外，胃內容物DNA未直接接觸海水，且兩種樣本類型之間的分類學多樣性和豐富度沒有統計學差異。因此，我們建議未來研究在擦拭並乾燥泄殖腔後，通過拭子擦拭泄殖腔外部來採集陰性對照。
另一個值得關注的問題是次級捕食（即獵物的獵物）。我們的研究結果表明，獵物的獵物的DNA很可能降解過度，無法被我們的引物擴增。如果存在獵物的獵物DNA被測序，我們的結果中會包含更多低營養級的物種。雖然次級捕食始終存在微小可能性，但總體上我們沒有在結果中發現預期的獵物的獵物DNA；因此，次級捕食可能不是一個主要問題，不應成為使用該方法的障礙。然而，這顯然是未來研究的一個主題。
最終，兩種樣本類型在獵物分類單元檢測方面效果相當，均可用於未來研究在個體和種群水平上描述食性。我們的結果證實，對泄殖腔拭子糞便DNA進行宏條碼分析這種非致死性、微侵入性方法，是鯊魚食性重建的高效且有效的替代方案。泄殖腔拭子提供了比其他方法（如形態學胃內容物鑑定和穩定同位素分析）更高的獵物分類學分辨率，且能夠識別不常被食用的稀有獵物物種以及消化速度更快的物種。在設計未來研究時，必須考慮所在地區遺傳數據庫的完備性以及哪些引物適合擴增特定鯊魚物種的獵物。與收集胃內容物相比，使用泄殖腔拭子收集糞便DNA更加容易和快捷，且對鯊魚造成的傷害極小或沒有傷害。鯊魚在沿海和開闊海洋生態系統中扮演著關鍵的功能角色，然而三分之一的鯊魚物種正面臨滅絕威脅。儘管其重要性，許多物種的基本自然歷史信息（如食性）在很大程度上仍是未知的。對此類基本生態信息的更好理解，可以通過實施更具體的基於生態系統的管理方案，來改善鯊魚的保護和管理。
