《Methods》：Refolding-assisted purification of native full-length TDP-43 compatible with BSL-2 safety regulations
编辑推荐：
本研究为解决肌萎缩侧索硬化（ALS）与额颞叶痴呆（FTD）中关键蛋白TDP-43难以在生物安全二级（BSL-2）条件下稳定制备的难题，开发了一种结合折迭辅助的纯化方案。该方案利用大肠杆菌表达，经尿素条件下IMAC捕获与柱上梯度尿素洗涤实现折迭，再切除SUMO标签，最终获得高纯度、单体的天然样全长TDP-43。其意义在于为在标准BSL-2实验室内安全、经济、可重复地研究TDP-43及其他朊病毒样蛋白提供了可靠方法。
想象一下，我们的身体细胞内有一些蛋白质，它们本应恪尽职守，却因为“错误折叠”而变成了“坏种子”。这些“坏种子”不仅自己失能，还能像传染一样，诱导周围正常的蛋白质也变成同样的错误结构，最终聚集成团，堵塞细胞，导致神经细胞死亡。这类蛋白质被称为朊病毒（Prion）或朊病毒样蛋白（Prion-like protein），它们是许多神经退行性疾病的罪魁祸首。其中，TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）就是一个典型的朊病毒样蛋白，它在两种可怕的疾病——肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic Lateral Sclerosis， ALS， 俗称“渐冻症”）和额颞叶痴呆（Frontotemporal Dementia， FTD）——的病理过程中扮演着核心角色。科学家们迫切需要在实验室里研究TDP-43，以揭示其致病机制并寻找治疗方法。
然而，研究TDP-43面临一个巨大挑战：如何获得它。TDP-43本身极易聚集，很难纯化出稳定、有活性的全长蛋白。更棘手的是，随着安全规范的更新，像TDP-43这类具有朊病毒样特性的蛋白，其研究被要求必须在生物安全二级（Biosafety Level-2， BSL-2）实验室中进行。这意味着许多传统的、依赖复杂流体系统（如快速蛋白液相色谱，FPLC）的纯化方法变得不适用或成本高昂，因为需要对整个系统进行严格且繁琐的净化，以防止具有“传染性”的蛋白污染。因此，开发一种能在标准BSL-2实验室内，使用基本设备即可安全、高效、可重复地纯化出高质量全长TDP-43的方法，成为了领域内一个亟待解决的关键技术瓶颈。
为了突破这一瓶颈，由Subhasis Dehury、Satyam Tiwari和Paolo De Los Rios组成的研究团队在《Methods》杂志上发表了一项重要研究。他们成功开发了一套“折迭辅助纯化”方案，能够从大肠杆菌的可溶部分中纯化出天然样的全长TDP-43。这套方案的核心优势在于，它完全可以在配备基本设备的普通BSL-2实验室内完成，无需依赖昂贵的专用FPLC系统，同时严格遵守了针对朊病毒样蛋白的安全操作规范。研究通过一系列严谨的质量控制手段证实，所获得的蛋白不仅纯度高，而且保持了正确的二级结构、主要以单体形式存在、并具有特异的DNA结合功能。这项研究为在更安全、更便捷的条件下深入开展TDP-43及相关疾病的研究铺平了道路。
为了开展这项研究，作者主要运用了以下关键技术方法：首先，他们采用了克隆策略，构建了带有N端His6-SUMO标签（用于增强可溶性和后续精确切除）的TDP-43表达质粒，并在大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL菌株中诱导表达。其次，他们建立了一套创新的纯化流程，关键步骤包括在4M尿素条件下使用耐EDTA/DTT的Ni2+-NTA树脂进行固定化金属亲和层析（IMAC）捕获，然后通过一个逐步降低尿素浓度（2M→1M→0M）的梯度洗涤在柱上进行蛋白重折迭。之后，使用Ulp1蛋白酶高效切除SUMO标签，获得天然N端的全长TDP-43。最后，他们建立了一套完整的质量控制体系，使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹评估完整性与纯度，利用质量光度法（Mass Photometry）在单颗粒水平分析寡聚状态，通过远紫外圆二色光谱（Far-UV Circular Dichroism）检测二级结构，采用荧光各向异性（Fluorescence Anisotropy）进行DNA结合功能验证，并使用光散射（Light Scattering）监测蛋白的稳定性与聚集倾向。
研究结果
2.1. 克隆策略与质粒表达
研究人员将His6-SUMO-TDP43构建体克隆到pET-28a(+)表达载体中。选择N端的His6-SUMO标签，是看中了其增强溶解度的特性，并且其可以被高度特异性的Ulp1蛋白酶精确切除，从而在目标蛋白上留下完整、天然的N端。这相比其他大标签（如MBP或GST）具有显著优势，因为后者常常会留下额外的氨基酸残基。
2.2. 蛋白表达与纯化流程
整个流程被清晰地划分为在BSL-1和BSL-2环境下进行的部分。在BSL-1条件下完成质粒转化、细菌培养、诱导表达、细胞裂解和裂解液澄清。随后，含有可溶性TDP-43的上清液被安全转移至BSL-2实验室进行后续所有操作。
在BSL-2实验室中，上清液经过滤后，加入4M尿素以防止聚集并增强结合。随后使用少量（1.5 ml）预平衡的耐EDTA的Ni2+-NTA珠进行结合，这种“树脂限量”条件旨在选择性地结合高亲和力的His6-SUMO-TDP43。结合后，通过在柱上使用逐步降低尿素浓度（2M， 1M， 0M）的缓冲液进行洗涤来实现蛋白重折迭。最后用含有300 mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白。SDS-PAGE分析显示，洗脱液中存在一个约58 kDa的主要条带，对应于His6-SUMO-TDP43，纯度约为90%。
2.3. SUMO标签切除与截断分析
为验证SUMO标签的切除效率和产物完整性，进行了时间进程实验。将His6-SUMO-TDP43与Ulp1蛋白酶在室温下孵育。SDS-PAGE结果显示，在不到5分钟内，约58 kDa的前体条带完全消失，同时出现了两个产物条带：约43 kDa的TDP-43和约17 kDa的His6-SUMO。使用抗TDP-43抗体进行的免疫印迹进一步确认，切掉标签后的产物是一个单一的约43 kDa条带，没有检测到非特异性切割或截断。
2.4. 质量光度法报告在SUMO标签切除前后TDP-43主要为单体
鉴于TDP-43易于形成多种寡聚体，研究人员使用质量光度法在单颗粒水平上分析了纯化蛋白的寡聚状态。结果显示，His6-SUMO-TDP43前体主要表现为一个约58 kDa的单峰（占总事件的~94%），符合单体分子量。在Ulp1切除标签后，质量分布转变为单一的约48 kDa峰（占总事件的~82%），这对应于单体形式的TDP-43。测得的48 kDa略高于SDS-PAGE显示的43 kDa，这在质量光度法对于部分无序或细长蛋白的分析中是常见现象，可能源于校准误差或蛋白形状/水合效应。重要的是，没有发现明显的二聚体或其他寡聚体峰，表明在该存储条件下蛋白以单体形式为主。
2.5. 远紫外圆二色光谱显示His6-SUMO-TDP-43具有折叠的混合α/β谱
为了验证蛋白的二级结构是否得以保留，研究人员记录了远紫外圆二色光谱。所得光谱显示了典型的α/β混合特征：在208 nm和224 nm附近存在负最小值，指示α螺旋含量；在216 nm附近存在负肩峰，指示β折叠含量。这与之前关于TDP-43结构的研究报道一致，证实了通过该纯化方案获得的蛋白具有正确的折叠构象。
2.6. 纯化的TDP-43具有功能活性并可特异性结合富含TG的单链DNA
为了验证纯化蛋白是否处于天然、有功能活性的状态，研究人员使用荧光各向异性实验检测了其DNA结合能力。已知TDP-43偏好结合富含TG的序列。实验中，将纯化的His6-SUMO-TDP43与FAM标记的特定序列（TG）4或非特异性对照序列（AC）4进行滴定。结果显示，当蛋白与（TG）4序列结合时，各向异性值呈现清晰、剂量依赖性的增加，拟合得到的解离常数（Kd）约为1.8 μM。相反，与对照序列（AC）4结合时，未观察到显著的结合信号。这证明纯化的蛋白具有功能活性，并保留了其特异性的DNA结合偏好。
2.7. SUMO切除触发快速聚集，可通过光散射分析检测
TDP-43的聚集倾向是其病理特征之一。为了监测这一特性，研究人员在37°C下，将His6-SUMO-TDP43与Ulp1蛋白酶孵合，并通过测量360 nm处的光散射来监测聚集过程。结果显示，加入Ulp1后，样品的浊度迅速急剧上升，表明切掉SUMO标签后的TDP-43在较高温度下发生了快速聚集。而未经Ulp1处理的His6-SUMO-TDP43样品仅表现出缓慢、微弱的浊度增加，单独的Ulp1则保持在基线水平。这一实验直观地证实了SUMO标签在维持TDP-43可溶性方面的关键作用，也模拟了其在病理条件下可能发生的聚集过程。
结论与讨论
本研究成功建立并验证了一套完整的、适配BSL-2安全规范的折迭辅助纯化方案，用于生产天然样的全长TDP-43。该方案的核心创新与优势在于：第一，它巧妙地利用树脂限量条件下的IMAC捕获和柱上梯度尿素洗涤，实现了对高亲和力目标蛋白的选择性纯化和有效重折迭，同时避免了复杂流体系统的使用和由此带来的严重净化负担。第二，全面采用无流体路径的单颗粒质量光度法进行寡聚态分析，彻底消除了传统方法中由TDP-43聚集造成的设备污染风险。第三，从完整性、纯度、寡聚状态、二级结构到功能活性，建立了一套多层次、相互验证的严格质量控制流程，确保了最终产物的可靠性与一致性。
该研究的意义重大。首先，它解决了在新型安全法规（要求对朊病毒样蛋白进行BSL-2防护）下，难以稳定获取高质量全长TDP-43的技术难题。所描述的方案仅需基础设备，成本效益高，且重复性好，极大地降低了相关研究的准入门槛。其次，该方案具有很好的普适性，其设计原则（如树脂限量选择、耐还原/螯合剂树脂的使用、大孔径浓缩过滤等）可 readily adaptable（易于调整）应用于其他具有挑战性的、易于聚集的朊病毒样蛋白的纯化。最后，研究所附的简明BSL-2标准操作程序，详细规定了针对朊病毒样蛋白的防护、净化和废物处理措施，为在安全前提下开展此类高风险蛋白的研究提供了重要的操作指南范本。总之，这项工作不仅为深入探索TDP-43在ALS/FTD中的致病机制及开发潜在疗法提供了关键的工具，也为整个朊病毒样蛋白研究领域贡献了一个安全、可靠且易于推广的蛋白质制备解决方案。
