《Microbiological Research》：Characterization of the Phage ΦK64 Depolymerase S2-4 and Its Therapeutic Effect Against K1 Serotype
Klebsiella pneumoniae
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本研究鉴定了ΦK64噬菌体编码的S2-4蛋白可有效降解肺炎克雷伯菌K1型胞外多糖（CPS），并通过冷冻电镜结构分析揭示其三聚体构象及催化中心，体外实验证实S2-4抑制生物膜形成并增强巨噬细胞吞噬，体内实验显示单次5μg剂量即可完全保护小鼠免受感染，为临床治疗提供了新策略。
赵瑞红|杜天娇|纪亚璐|任卓璐|姜珊珊|衡茹|顾敬民
中国吉林省长春市吉林大学兽医学院人畜共患病研究所、教育部人畜共患病重点实验室、严重人畜共患病诊断与治疗国家重点实验室，邮编130062
摘要
含有荚膜多糖（CPSs）的肺炎克雷伯菌的感染率和耐药性逐年增加，导致严重的人类和动物感染。来自噬菌体的降解酶可以分解CPSs，因此具有治疗细菌感染的潜力。然而，关于肺炎克雷伯菌噬菌体降解酶如何水解CPSs的机制知之甚少。在本研究中，发现噬菌体ΦK64编码的S2-4是一种针对K1血清型肺炎克雷伯菌 CPSs的强效降解酶。冷冻电子显微镜结构分析显示，S2-4形成一个类似纺锤体的同三聚体，包括一个颗粒结合域、一个核心受体结合域、一个插入域和一个C端域。结构测定结果表明，S2-4具有多个催化中心，这可能有助于其强效的降解活性。S2-4抑制了肺炎克雷伯菌的生物膜形成，破坏了已形成的生物膜，并增强了巨噬细胞对经降解酶处理的细菌的黏附和吞噬作用。在小鼠模型中，单剂量5微克的S2-4即可提供完全的保护，这突显了S2-4的强效降解活性。这些结果表明，S2-4是一种针对K1血清型肺炎克雷伯菌 CPSs的强效降解酶，具有临床控制肺炎克雷伯菌感染的潜力。
引言
肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）是一种重要的病原体，与医院获得性感染和社区获得性感染相关，可引起肺炎、菌血症和软组织感染等问题（Lee等人，2016a；Heng等人，2024）。此外，肺炎克雷伯菌还会通过引起乳腺炎在乳制品行业和肺炎、乳腺炎及腹泻在养猪业中造成重大经济损失（Collins AMMizzi，2025；Tong等人，2025）。近年来，高毒力肺炎克雷伯菌（hvKp）的感染率和耐药性逐年增加（Lee等人，2016a；Heng等人，2024）。传统抗生素往往无法有效治疗这些细菌引起的败血症休克。根据世界卫生组织（WHO）的最新报告，至少在16个国家和地区发现了高毒力和耐药的肺炎克雷伯菌菌株，包括中国、美国、英国和印度，其中大多数限于K1或K2血清型，约占70%（Shon等人，2013），这对抗生素的适用性和公共卫生构成了重大威胁（Li等人，2023；Heng等人，2024），因此需要开发新的控制策略（2022）。
荚膜是肺炎克雷伯菌的主要毒力因子之一，对其致病性至关重要。目前，根据构成荚膜多糖（CPS）重复单位的糖苷键，肺炎克雷伯菌的荚膜血清型至少可分为79种类型（Pan等人，2015a）。CPSs可以在细菌周围形成保护屏障，帮助细菌抵御不良环境条件。此外，CPSs还能抵抗抗生素的渗透（Lee等人，2017；Russo和Marr，2019），逃避宿主免疫细胞的吞噬作用（Paczosa和Mecsas，2016），并促进生物膜的形成（Dzul等人，2011；Chan和Abedon，2015）。因此，多糖降解剂被认为是针对存在CPSs的病原菌的潜在治疗化合物（Maciejewska等人，2018；Majkowska-Skrobek等人，2018；de Oliveira Júnior NGFranco，2020）。
噬菌体降解酶在噬菌体感染过程中特异性识别、结合并降解肺炎克雷伯菌表面的CPSs（Latka等人，2019；de Oliveira Júnior和Franco，2020）。据报道，降解酶在体外和体内都具有强烈的抗毒力和抗菌作用，同时还能增强免疫系统的敏感性（Chan和Abedon，2015；Olszak等人，2017）。此外，降解酶还可以通过降解生物膜基质中的多糖来去除生物膜（Lin等人，2014；Squeglia等人，2020；Li等人，2022；Cai等人，2023）。尽管一些研究已经探讨了噬菌体降解酶的作用（Squeglia等人，2020；Tu等人，2022；Cai等人，2023；Huang等人，2024），但关于肺炎克雷伯菌噬菌体降解酶如何水解CPSs的机制仍知之甚少。因此，了解降解酶的结构对于深入理解其机制及其作为抗菌剂的潜在应用至关重要。
先前的研究预测，K1血清型肺炎克雷伯菌噬菌体ΦK64的尾丝蛋白S2-4具有降解酶功能（GenBank登录号YP_007003187.1）（Pan等人，2017）。然而，S2-4如何识别和降解肺炎克雷伯菌表面的CPSs的分子机制，以及其在体内和体外的抗菌活性，仍有待进一步阐明。在本研究中，我们使用冷冻电子显微镜（cryo-EM）确定了S2-4的结构，并通过定点突变确定了其潜在的活性位点。此外，我们还评估了巨噬细胞对S2-4处理的肺炎克雷伯菌的吞噬敏感性、血清对S2-4处理的肺炎克雷伯菌的杀灭效果以及降解酶的体内治疗效果。
实验部分
动物
从中国沈阳的辽宁省实验动物资源中心购买了6至8周大的雌性C57BL/6小鼠。饲养严格遵循《实验动物护理和使用指南》。饲料和新鲜水可自由获取。
细菌菌株和细胞培养条件
本研究中使用的所有肺炎克雷伯菌菌株均来自吉林大学第一医院临床分离株。这些菌株的荚膜类型根据先前的描述进行了鉴定
S2-4可降解K1血清型肺炎克雷伯菌的CPS
纯化的S2-4通过十二烷基硫酸钠凝胶电泳（SDS-PAGE）确认其大小约为97 kDa（图1A）。在浓度低至0.01–0.05 ng/μL的S2-4处理平板上观察到了明显的透明晕圈（图S1A）。此外，对95株肺炎克雷伯菌进行了活性测试，其中47株在S2-4处理后形成了透明斑点，这些菌株均属于K1荚膜类型（表S3）。S2-4的pH耐受范围为4–11（图S1B）
讨论
肺炎克雷伯菌是一种具有重大临床意义的病原体。一般来说，动物来源的肺炎克雷伯菌的抗生素耐药性相对较轻。相比之下，医院获得的肺炎克雷伯菌菌株通常表现出多重耐药性，使得抗生素越来越无效（Li等人，2024；Shah等人，2025）。然而，先前的研究表明，牛源肺炎克雷伯菌可以从人源菌株继承抗生素耐药基因，从而增加了
结论
在本研究中，我们发现噬菌体ΦK64中的S2-4蛋白是一种针对K1血清型肺炎克雷伯菌 CPSs的强效降解酶。电子显微镜结构分析显示，S2-4形成一个类似纺锤体的同三聚体，包含一个颗粒结合域。S2-4的活性位点包含Tyr557、His614和Glu694残基，这些残基共同促进了CPS的水解切割。此外，S2-4抑制了肺炎克雷伯菌的生物膜形成，破坏了已形成的生物膜，并增强了
未引用的参考文献
(Chan BKAbedon, 2015; Emsley PCowtan, 2004; Paczosa MKMecsas, 2016; Russo TAMarr, 2019; The, 2022)
资助
本工作得到了中国国家自然科学基金（项目编号32222083、32072824和32371344）和中央高校基本科研业务费的支持。
CRediT作者贡献声明
姜珊珊：正式分析。衡茹：写作——审稿与编辑、资金获取、正式分析、数据管理。纪亚璐：写作——初稿撰写、验证、正式分析、数据管理。任卓璐：正式分析。顾敬民：写作——审稿与编辑、项目管理、资金获取、概念构思。赵瑞红：写作——初稿撰写、数据可视化、实验研究、正式分析、数据管理。杜天娇：正式分析、数据管理。致谢
我们感谢浙江大学生命科学研究所（LSI）的核心设施工作人员提供的仪器和技术支持，特别感谢Shang Weina女士和Ma Jie女士在仪器使用方面的宝贵帮助和建议。同时，我们也感谢中国科学技术大学和浙江大学冷冻电镜中心的工作人员，特别是Gao Yongxiang博士和Chang Shenghai博士的支持
