《Microchemical Journal》：Characterization of polysaccharides from oenological byproducts by a novel multiple reaction monitoring mass spectrometry method
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本研究针对传统酒类副产物（如商业甘露糖蛋白、酒泥和葡萄果渣提取物）中单糖组分定量方法存在操作复杂、使用有害试剂等问题，开发并验证了一种基于1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化结合HPLC-MS/MS-MRM技术的稳健分析方法。该方法实现了对11种单糖的精确、高灵敏度定量，检出限（LOD）和定量限（LOQ）低，并成功应用于不同来源提取物的组分分析，揭示了其单糖与多糖家族构成的显著差异，为评估这些副产物的潜在应用价值与工艺特性提供了关键化学信息。
在葡萄酒酿造过程中，会产生大量的副产物，如葡萄皮渣和酒泥，这不仅带来了环境压力，也造成了宝贵资源的浪费。近年来，人们日益关注从这些“废料”中回收高附加值化合物，其中多糖就是一个重要目标。葡萄酒中的多糖主要来源于葡萄细胞壁和酵母，它们不仅是构成酒体的重要成分，更对酒的稳定性（如防止酒石酸结晶和蛋白质浑浊）和感官品质（如口感、涩味和颜色）有着深远影响。例如，甘露糖蛋白（MP）和富含阿拉伯糖和半乳糖的多糖（PRAG）就扮演着关键角色。然而，多糖在酒中的作用不仅取决于其总量，更与其精细的结构和组成息息相关。因此，精确地“解码”这些多糖由哪些单糖“积木”构成，成为了理解其功能、进而实现副产物高值化利用的关键一步。
传统的分析方法，如气相色谱-质谱联用（GC-MS），虽然常用，但存在明显短板：其衍生化步骤需要使用有害且气味难闻的吡啶，反应条件苛刻；并且每个单糖会生成多个衍生物峰，导致色谱图复杂、定量困难。这些限制呼唤一种更安全、更高效、更精准的分析新方法。
为此，由Montserrat Due?as、Ignacio García-Estévez等人领导的研究团队，在《Microchemical Journal》上发表了一项研究，他们开发并验证了一种基于液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）和多重反应监测（MRM）的创新方法，旨在精准定量葡萄酒工业副产物中的单糖组成，从而深入表征其多糖结构。
研究人员采用了几个关键的技术方法：首先，从不同来源获取样本，包括五款商业甘露糖蛋白（MPM, MP1, MP2, MPP, MPF）、自白葡萄酒和红葡萄酒酒泥中提取的甘露糖蛋白，以及从Verdejo品种的白葡萄果渣中提取的可溶性多糖。核心分析技术是，先将样品中的多糖用三氟乙酸（TFA）水解为单糖，然后利用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）进行衍生化，最后通过优化后的HPLC-MS/MS-MRM方法进行分析和定量。方法学验证严格遵循了美国食品药品监督管理局（FDA）的指导原则。
2. 材料与方法
本研究系统建立了从样品提取到分析定量的完整流程。样品包括商业甘露糖蛋白和从酒泥、葡萄果渣中实验室提取的多糖。单糖分析采用PMP衍生化结合HPLC-MS/MS技术，通过优化的色谱条件（使用Poroshell 120 EC-C18柱，以40 mM乙酸铵:乙腈和乙腈:水为流动相进行梯度洗脱）实现了包括木糖和阿拉伯糖在内的多种单糖的良好分离。质谱检测在正离子模式下进行，针对每种PMP衍生化单糖选择了两个特征性的母离子-子离子对（MRM通道）进行监测（例如，甘露糖/葡萄糖/半乳糖的通道为511→373和511→175），并选用2-脱氧-D-葡萄糖作为内标以提高定量的重现性。方法经过了全面的验证，包括构建校准曲线、评估准确度（回收率）、日内与日间精密度以及测定检出限（LOD）和定量限（LOQ）。
3. 结果与讨论
3.1. 色谱与质谱条件的优化
通过优化色谱溶剂和梯度，成功解决了木糖与阿拉伯糖共流出的问题，获得了所有目标单糖的良好分离。质谱参数针对每种单糖的PMP衍生物进行了优化，选择其+离子[M + 2PMP - H2O + H]+作为母离子，并监测两个丰度最高的碎片离子（m/z 373和m/z 175）以提升方法的灵敏度。
3.2. 内标选择
在测试的几种候选内标物（2-脱氧-D-核糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰甘露糖胺和2-脱氧-D-葡萄糖）中，2-脱氧-D-葡萄糖表现出最低的信号变异性，因此被选为最终的内标。
3.3. 方法验证
所建立的方法表现出优异的性能。所有单糖的校准曲线在各自的浓度范围内均呈现良好的二次拟合，相关系数（R2）均高于0.992。方法的准确度很高，所有单糖的回收率在98%至108%之间。日内和日间精密度良好，变异系数（CV）分别介于6.2%-10.1%和7.7%-16.1%之间。此外，方法具有很高的灵敏度，各单糖的LOD在0.005至0.063 mg L-1之间，LOQ在0.015至0.188 mg L-1之间，足以满足酒类副产物中低浓度单糖的检测需求。
3.4. 酒类副产物的单糖组成表征
应用该方法分析了六种商业甘露糖蛋白、两种酒泥提取物和一种葡萄果渣提取物。结果表明，不同来源的提取物单糖组成差异显著。在商业甘露糖蛋白和酒泥提取物中，甘露糖和葡萄糖是主要的单糖，占总量的53%至97%，这证实了它们主要由酵母细胞壁衍生的甘露糖蛋白和葡聚糖构成。值得注意的是，不同商业产品之间也存在差异，例如MP2几乎全部由甘露糖（约97%）组成，而MPF的甘露糖和葡萄糖比例则接近1:1。在从白葡萄果渣（WPS）提取的多糖中，组成截然不同，半乳糖醛酸、阿拉伯糖和半乳糖各占约34%，这指示了其中富含同型半乳糖醛酸（HG）和PRAGs等多糖家族。
3.5. 酒类副产物的多糖组成确定
基于测得的单糖组成，研究人员进一步估算了各提取物中多糖家族的相对含量。在商业甘露糖蛋白和酒泥提取物中，甘露糖蛋白（MP）是主导成分（52%-97%），其次是葡聚糖（GP）。葡萄果渣提取物则主要由同型半乳糖醛酸（HG，约51%）和PRAGs（约35%）构成。对单糖比例（如阿拉伯糖/半乳糖比、鼠李糖/半乳糖醛酸比）的分析，为理解多糖结构中中性侧链的比例和类型提供了更深层次的见解。
4. 结论
本研究成功开发并验证了一种基于PMP衍生化-HPLC-MS/MS-MRM的单糖定量方法。该方法克服了传统GC-MS方法的缺点，具有操作更安全、色谱行为更简单、灵敏度高、准确性好等优势。应用该方法对不同酒类副产物提取物的分析，清晰揭示了其单糖及多糖家族组成的多样性和特异性：商业产品和酒泥提取物以酵母来源的甘露糖蛋白和葡聚糖为主，而葡萄果渣提取物则富含来源于果胶的HG和PRAGs。这些发现强调了不同来源提取物在化学本质上的显著差异。
这项研究的意义在于，它提供了一种强有力的分析工具，能够为准确评估各种酒类副产物提取物的组成、理解其在葡萄酒体系中的潜在行为（如稳定性和感官影响）、以及指导其针对性的工业应用（如作为天然添加剂）提供至关重要的化学依据。该方法不仅适用于葡萄酒领域，未来还有潜力拓展至其他食品和饮料基质的多糖研究，推动相关领域的科学认知与技术进步。
