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本文是一篇关于纳米抗体作为GPCR新型配体的权威综述。文章系统阐述了纳米抗体如何凭借其独特的结构优势（如凸面互补决定区和长CDR3），克服传统小分子药物在靶向GPCR（特别是具有有限胞外区的家族A GPCR）时面临的选择性难题。综述回顾了骆驼免疫、合成文库和计算设计等关键发现方法，并详细介绍了纳米抗体如何通过作用于非保守的胞外表位，稳定特定的受体构象，从而实现从拮抗剂、激动剂、反向激动剂到变构调节剂的多样化药理学功能。文章还探讨了通过构建双特异性或双价分子等抗体工程技术，实现细胞和组织特异性靶向等新治疗策略的潜力。总之，该文揭示了纳米抗体作为下一代GPCR靶向疗法的巨大前景，为开发高选择性、作用机制新颖的治疗药物提供了重要洞见。
G蛋白偶联受体（GPCRs）是人类基因组中最大的膜受体家族，超过30%的已上市药物以其为靶点。然而，传统的小分子药物在实现GPCR亚型选择性方面常面临挑战。近年来，源自骆驼科动物重链抗体的单域抗体，即纳米抗体，已从结构研究的辅助工具演变为一类全新的GPCR配体。与常规抗体相比，纳米抗体仅包含一个免疫球蛋白可变区（VHH），其凸面互补决定区和较长的CDR3环使其能够触及GPCR表面的裂缝，包括那些胞外区有限的家族A GPCR。
纳米抗体发现方法的进展
纳米抗体的发现主要依赖于骆驼免疫，即用纯化的GPCR、过表达GPCR的细胞或编码受体的DNA质粒进行免疫，然后从B细胞中扩增VHH序列并构建噬菌体展示文库进行筛选。这种方法对于生化不稳定或难以高表达的GPCR存在挑战。合成纳米抗体库通过基于结构数据库序列和天然骆驼免疫库设计的互补决定区（CDRs），为克服自身耐受、降低成本和缩短发现时间（从数月到数周）提供了途径。尽管完全合成策略缺少天然免疫应答带来的亲和力成熟，但可以通过易错PCR或定点诱变进行体外亲和力成熟来克服。合成筛选的优势在于可以精细控制每一步，并导向特定的结合特性，例如通过配体竞争或靶向受体胞外区的表位导向方法富集特定构象状态的纳米抗体。
近年来，计算设计平台为纳米抗体发现提供了前景广阔的新路径。例如，AlphaFold-Multimer成功从包含10，000个候选克隆的in silico库中识别出针对孤儿GPCR MRGPRX2的纳米抗体结合剂。生成式蛋白质设计方法，如Nabla Bio的联合原子建模（JAM）系统和Chai Discovery的Chai-2平台，也展示了针对特定表位（如趋化因子受体的胞外环）设计纳米抗体的能力，成功获得了具有纳摩尔级亲和力的激动剂和拮抗剂。计算策略还能设计非纳米抗体蛋白配体，例如通过RFdiffusion方法设计靶向GPCR配体结合口袋的肽段结合剂。这些进展凸显了计算平台在扩展GPCR靶向配体发现范围方面的潜力。
家族A GPCR的纳米抗体配体
越来越多的结构数据显示，许多胞外结合的纳米抗体具有共享的结合模式：CDR 1和2区主要与胞外环（ECLs）相互作用，而CDR3则深入受体的正构配体结合口袋。这类似于阿片肽配体提出的“信息-地址”模型，即配体的一部分赋予受体选择性（“地址”），另一部分编码药理学功能（“信息”）。这一模型表明，纳米抗体支架易于进行药理学调谐。
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趋化因子受体确立基于纳米抗体的GPCR拮抗作用
纳米抗体作为GPCR配体的应用首先在趋化因子受体家族中确立。针对CXCR2、CXCR4、ACKR3等趋化因子受体的纳米抗体大多作为拮抗剂，直接竞争内源性趋化因子配体的结合。研究显示，与受体胞外环的相互作用对于实现完全抑制至关重要。对ACKR3纳米抗体拮抗剂和反向激动剂的研究进一步表明，纳米抗体可以通过不同的变构机制调节同一GPCR，实现从拮抗到反向激动等多种功能。
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纳米抗体为μ阿片受体提供选择性
针对μ阿片受体（μOR）的纳米抗体NbE仅与ECL2相互作用，从而实现了对μOR相对于δOR、κOR和伤害感受素OR的完全选择性。其延长的CDR3环插入μOR的正构口袋，起到竞争性拮抗剂的作用。
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发现apelin受体的纳米抗体激动剂
骆驼免疫衍生的纳米抗体JN-241是apelin受体（APJ）的拮抗剂。通过在CDR3中插入单个酪氨酸，JN-241被转化为完全激动剂JN241-9。结构研究表明，该酪氨酸在G蛋白结合后与跨膜区（TM）的疏水残基发生空间碰撞，促使TM6向外移动，从而激活受体。一项创新的基于功能的筛选策略——将糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的纳米抗体库展示在表达GPCR和TANGO β-arrestin募集报告系统的细胞表面——直接链接了纳米抗体结合与受体信号输出，高效地发现了APJ的纳米抗体激动剂和拮抗剂。
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嵌合GPCR产生黑皮质素纳米抗体激动剂
通过将β2肾上腺素受体（β2AR）的C末端和胞内环嫁接到黑皮质素4受体（MC4R）上，并融合G蛋白模拟纳米抗体Nb80，构建了一个稳定在活性状态的MC4R嵌合体。以此作为免疫原进行骆驼免疫，并通过Nb80招募进行筛选，获得了高选择性激动剂pN162。其CDR3中的精氨酸直接与TM2和TM3的残基相互作用，绕过了MC4R肽类激动剂所需的钙离子依赖激活机制。
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构象稳定化产生毒蕈碱受体纳米抗体配体
通过设计分别限制或促进TM6向外移动的M1毒蕈碱乙酰胆碱受体（M1R）融合蛋白，稳定其失活或活性构象，并在合成筛选中用配体结合受体封闭胞内表面，从而发现了靶向受体胞外囊区的纳米抗体。这些纳米抗体激动剂和拮抗剂选择性地识别并结合变构位点的活性或失活构象，通过变构机制调节受体信号。
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靶向AT1R的纳米抗体编码竞争性和变构活性
针对血管紧张素II 1型受体（AT1R）的纳米抗体通过竞争性和变构机制发挥作用。拮抗剂AT118-H通过其CDR3与AT1R的正构口袋结合，稳定了受体胞外区的活性样构象，但胞内侧仍处于失活状态。这种较浅的结合模式使其能够作为变构调节剂，增强某些小分子拮抗剂的活性，表现出探针依赖性。通过结构引导的蛋白质工程，可以将仅具有变构抑制活性的纳米抗体（如AT209）转变为竞争性拮抗剂，这凸显了纳米抗体支架内可演化的GPCR药理学。
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扩展的变构纳米抗体配体
针对食欲素受体2（OX2R）和α1-肾上腺素能受体（α1AR）的合成纳米抗体Sb51和Nb29，通过其CDR3堵塞正构口袋的入口，防止小分子配体解离，从而增强配体亲和力。针对视紫红质的纳米抗体Nb2则通过结合N末端、ECL2和N-聚糖，限制胞外区的构象变化，从而抑制受体激活。
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纳米抗体调节富含亮氨酸重复序列GPCR的活性
针对富含亮氨酸重复序列GPCR 4（LGR4）胞外域的纳米抗体（如3E8和4C4）通过靶向铰链区抑制受体功能。针对松弛素家族肽受体1（RXFP1）LRR域的纳米抗体被构建成双特异性抗体降解剂，通过靶向清除细胞表面的RXFP1有效抑制下游信号。
靶向黏附GPCR NTF的纳米抗体
黏附GPCR包含一个大的N端片段（NTF）。针对黏附GPCR G2（ADGR2）NTF的合成纳米抗体改变了跨膜结构域胞外环的构象，表明纳米抗体可以通过参与两个结构域间的变构网络来调节信号。
靶向家族C GPCR的纳米抗体
家族C GPCR（如钙敏感受体CaSR和代谢型谷氨酸受体mGluR）具有大的胞外配体结合域（LBD），是纳米抗体变构调节的理想靶点。
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结合LBD的纳米抗体抑制和增强CaSR信号
针对CaSR LBD的纳米抗体（如Nb32和Nb-2D11）通过破坏活性态二聚体界面的形成来抑制受体激活。另一些纳米抗体（如Nb4）则作为正性变构调节剂，需要共激动剂L-色氨酸和Ca2+的存在，进一步稳定LBD的活性状态。
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纳米抗体助力解析谷氨酸受体活性
针对mGluR5的纳米抗体Nb43通过结合LBD顶部来增强正构激动剂的结合和信号。针对mGluR4同源二聚体的纳米抗体DN45能够完全激活受体，并可作为mGluR2/4异源二聚体的正性变构调节剂。针对mGluR2同源二聚体的纳米抗体DN10和DN13可作为正性变构调节剂，其中DN10还具有部分激动剂活性。它们选择性识别mGluR2同源二聚体，并通过跨LBD活性态的扩展表位结合来稳定其构象。二价形式的DN13能够穿过血脑屏障，并在精神分裂症小鼠模型中纠正认知缺陷。
家族F GPCR
家族F GPCR中的Frizzled受体含有胞外富含半胱氨酸结构域（CRD）。针对FZD3 CRD的纳米抗体Nb8直接竞争Wnt配体的结合。当其被二聚化成Fc融合变体时，竟能激活FZD3介导的β-catenin信号通路，这与通常Wnt结合FZD3的效果不同，提示纳米抗体诱导的受体二聚化可以差异化调节信号。
纳米抗体-配体偶联物调节信号
将靶向GPCR胞外表位的纳米抗体与肽类配体片段偶联，可以产生具有受体亚型选择性和信号偏置特性的双位点配体。例如，靶向PTHR1胞外区的纳米抗体与甲状旁腺激素（PTH）片段融合后，显示出对PTHR1的严格选择性，并偏向于Gαs信号通路。类似策略也应用于家族A GPCR（如NK1R和AT1R），表明纳米抗体与胞外环的相互作用可以微调G蛋白的选择性。
结论与未来方向
纳米抗体已成为能够稳定特定GPCR构象以调节多样化信号输出的分子配体。其通过识别非保守胞外表位天然具备高受体亚型选择性，并能作为高特异性的变构调节剂。未来的方向包括：进一步探索如何通过突变或理性结构工程来演化纳米抗体的药理学功能；结合计算平台开发改进的预测模型；以及工程化能够稳定偏好性结合特定胞内效应器的受体构象的“偏置”纳米抗体配体。将纳米抗体与细胞类型特异性抗体结合成双特异性格式，有望在受体、信号和组织水平实现高度选择性的靶向治疗。纳米抗体正在解锁传统小分子无法实现的新机制洞察和治疗策略，加速下一代GPCR靶向疗法的开发。
