细胞外结构域依赖的调控：揭秘B1类GPCR信号转导的新范式

《Molecular Pharmacology》：Extracellular domain-dependent modulation of class B1 GPCR signaling

本文聚焦于传统认为仅作为配体“亲和力陷阱”的B1类GPCR胞外域（ECD），揭示了其在GLP-1、GCG和GIP受体中保守的“PWYLPW”基序能以配体和受体依赖的独特方式，变构调控下游cAMP和βarr信号通路，或通过影响受体N-连接糖基化决定其功能性表达，挑战了经典的B1类GPCR“两步结合”模型，为理解此类受体的激活机制及药物研发提供了全新视角。

长期以来，科学家们对一大类名为G蛋白偶联受体（GPCR）的细胞“天线”如何工作充满好奇。其中，B1类GPCR家族尤为特殊，它们负责识别血液中的多肽“信使”，如调控血糖的胰高血糖素样肽-1（GLP-1），在维持人体血糖稳定和能量平衡中扮演关键角色。传统的教科书理论描述了一个简洁的“两步结合”模型：多肽配体首先与受体伸出细胞外的“大手”——胞外结构域（ECD）牢牢抓住（这步决定结合力强弱），然后配体的“头部”再钻进受体嵌入细胞膜的部分，像钥匙一样转动锁芯，从而启动细胞内的信号反应。在这个经典框架下，ECD被认为只是一个被动的“亲和力陷阱”，其作用仅限于捕捉配体，而对后续信号“开多大、关多快”没有发言权。

然而，近年来的一些蛛丝马迹开始挑战这一观点。例如，有研究发现，GLP-1受体（GLP1R）细胞膜外的某些环状结构（胞外环，ECL）居然能影响下游信号传导，且不改变配体结合力。这暗示着，细胞膜外的部分可能并非旁观者。那么，作为ECD本身，这个理论上只负责“初次握手”的区域，是否也隐藏着调控信号“方向盘”的秘密开关呢？来自Eli Lilly and Company的研究人员Alex D. White等人决定深入探究这一问题，他们的研究成果发表在《Molecular Pharmacology》上，为我们揭开了B1类GPCR信号传导更为复杂和精细的一面。

为了系统回答上述问题，研究人员主要运用了以下几类关键技术方法：利用定点突变技术构建了一系列受体突变体；采用基于HTRF（均相时间分辨荧光）和Tag-lite体系的竞争与饱和结合实验测定配体结合亲和力；通过cAMP积累实验、基于BRET（生物发光共振能量转移）的mini-G_s招募实验评估G_s蛋白通路活性；利用基于BRET的β-抑制蛋白2（βarr-2）招募实验和基于旁观者BRET的内化实验评估βarr通路活性及受体内存；通过细胞表面ELISA、细胞表面生物素化结合Far Western blot以及PNGase F酶切实验，分析受体在细胞膜的表达水平、糖基化状态及不同糖型。

研究结果

发现ECD中保守的“PWYLPW”基序及其功能分化

研究人员在对GLP1R进行突变筛选时，意外发现其ECD中第90位的脯氨酸（P90）和第91位的色氨酸（W91）突变为丙氨酸（A）后，虽然不影响配体（GLP-1）的结合亲和力与细胞膜表达量，却能显著削弱GLP-1诱导的cAMP积累和βarr-2招募。进一步分析发现，这种cAMP信号减弱源于受体与G_s蛋白（通过mini-G_s表征）耦合能力的下降。引人深思的是，当使用不与这两个残基直接相互作用的小分子非肽类激动剂danuglipron刺激时，P90A和W91A突变对cAMP信号却几乎无影响，但对βarr-2招募的削弱依然存在。这首次提示，ECD的特定残基能以配体依赖的方式差异调控G蛋白和βarr通路。

通过序列比对，研究者在胰高血糖素受体（GCGR）和葡萄糖依赖性胰岛素释放肽受体（GIPR）中也发现了完全相同的六氨基酸基序“PWYLPW”（在GLP1R中对应第86至91位）。为便于描述，他们将该基序中的残基依次命名为P₁, W₁, Y, L, P₂, W₂。

W₁, P₂, W₂位点：变构调控信号通路

针对GLP1R PWYLPW基序的逐个残基突变分析显示：

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  W₁位点（W87A）：对GLP-1或danuglipron诱导的cAMP信号无影响，但会同等程度地削弱两者诱导的βarr-2招募。这表W₁是一个变构调控βarr通路的关键位点，其作用不依赖配体直接接触。
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  P₂/W₂位点（P90A/W91A）：如前所述，这两个位点对cAMP信号的调控是配体依赖的（仅影响GLP-1，不影响danuglipron），而对βarr通路的抑制则是配体非依赖的。这表明它们可能参与形成了一个变构网络，将配体结合信息差异性地传递给下游效应器。

P₁, Y, L位点：决定受体糖基化成熟与功能性表达

与上述位点不同，将GLP1R的P₁（P86）、Y（Y88）或L（L89）突变为丙氨酸，会导致受体对GLP-1和danuglipron均完全丧失反应能力，成为“失功能”受体。深入机制探索发现，这些突变体虽然能抵达细胞膜，但其蛋白糖型与野生型（WT）受体显著不同：它们仅以低分子量形式存在，缺乏WT受体中代表完全糖基化“成熟”形式的高分子量条带。经PNGase F酶切实验证实，这些突变体对去糖基化不敏感，表明其N-连接糖基化过程严重受损。用糖基化抑制剂衣霉素（tunicamycin）处理细胞，也能完全阻断WT受体的信号传导。因此，P₁, Y, L位点并非直接参与信号传导，而是作为受体正确折叠、糖基化成熟并最终获得信号能力的关键决定因素。

保守基序在不同受体中发挥差异化作用

当研究者将同样的突变策略应用于GCGR和GIPR时，发现了令人惊讶的受体特异性现象：

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  P₁, Y, L位点：在GCGR和GIPR中突变这些位点，同样导致完全失活，与GLP1R一致，暗示其保守的“质量控制”功能。
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  W₁位点：在GCGR和GIPR中突变W₁，也呈现出与GLP1R类似的表型——不影响cAMP信号但削弱βarr招募，功能保守。
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  P₂/W₂位点：功能出现显著分化。
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    GCGR：P₂/W₂突变不仅削弱信号效能，还导致激动剂效价大幅右移，提示这些位点可能同时影响GCG的结合亲和力。
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    GIPR：P₂突变仅削弱βarr招募而不影响cAMP信号；而W₂突变则导致受体完全失活，表型最为严重。

这些结果表明，即使在一个100%保守的氨基酸基序内，不同受体也可能“挪用”相同的残基来实现独特的功能编排。

研究结论与意义

本研究系统性地揭示，在胰高血糖素受体家族的三个关键成员（GLP1R， GCGR， GIPR）中，其ECD内保守的PWYLPW基序以两种主要机制深刻调控着受体功能：其一，通过变构网络（如W₁, P₂, W₂位点）调控下游cAMP和/或βarr信号通路，且这种调控表现出配体依赖（如GLP1R的P₂/W₂对G蛋白信号）和配体非依赖（如对βarr信号）的复杂模式；其二，作为决定受体正确糖基化、成熟及膜定位的关键质量控制点（如P₁, Y, L位点）。此外，该研究还强调了受体特异性的重要性，即使在同一家族、拥有完全一致保守基序的受体间，相同残基的功能也可能大相径庭。

这项工作的意义深远。首先，它有力地挑战了B1类GPCR经典的“两步结合”模型中ECD仅作为被动亲和力陷阱的简化观点，将ECD提升为主动参与和精细调控下游信号传导的关键功能模块。其次，研究揭示了ECD残基能够实现信号通路偏向性调控（例如，W₁位点选择性影响βarr通路），这为设计新一代“偏向性激动剂”药物提供了潜在的新靶点，尤其是对于主要结合跨膜区的小分子药物而言，此前ECD的调控作用常被忽视。最后，研究强调了在药物研发中，即使针对高度同源的受体靶点，也需要充分考虑其独特的信号决定因素，不能简单地进行类推。这项研究为更深入理解B1类GPCR的激活机制打开了新的大门，并为针对这类重要药物靶点的精准疗法开发奠定了新的理论基础。