新发现微蛋白MUCP1通过调控线粒体琥珀酸转运促进结直肠癌代谢重编程与表观遗传重塑

《Neoplasia》：A novel microprotein MUCP1 promotes colorectal cancer metabolic reprogramming by regulating mitochondrial succinate transport

本论文聚焦于结直肠癌(CRC)中代谢重编程的分子调控机制这一关键科学问题。研究人员针对长链非编码RNA(lncRNA)编码的功能性微蛋白这一新兴领域，揭示了lncRNA MUC20-OT1编码的微蛋白MUCP1在CRC中的重要作用。研究发现，MUCP1定位于线粒体外膜，通过促进SLC25A10介导的线粒体琥珀酸(succinate)外排，进而增强H3K4me3组蛋白修饰，从而激活谷氨酰胺(glutamine)代谢相关基因的转录，最终维持CRC细胞的高代谢需求与恶性进展。这项工作不仅鉴定了一个全新的lncRNA编码的致癌微蛋白，更为理解肿瘤代谢与表观遗传的偶联机制提供了新视角，并提示MUCP1可能成为CRC治疗的潜在代谢脆弱性靶点。

　　

在癌症研究的复杂图景中，结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)因其高发病率和死亡率而备受关注。科学家们早已发现，癌细胞为了满足其疯狂增殖的需求，会对其内部的代谢网络进行彻底的“改造升级”，这一过程被称为代谢重编程。然而，驱动这一复杂过程的幕后“调控者”究竟是谁，许多细节仍笼罩在迷雾之中。近年来，一类曾被视为“基因组暗物质”的长链非编码RNA(Long Non-coding RNA, lncRNA)逐渐走到舞台中央，它们被发现能在多个层面调控肿瘤的进展。更令人惊讶的是，一些被标注为“非编码”的lncRNA，实际上暗藏玄机，能够翻译生成具有重要功能的微小蛋白质或肽段。这些“微蛋白”如同潜藏的特工，在细胞代谢等关键生命活动中扮演着不为人知却至关重要的角色。那么，在结直肠癌中，是否存在这样的lncRNA编码的微蛋白？它们又是如何精细调控肿瘤的代谢，从而推动癌症发展的呢？发表在《Neoplasia》上的这项研究，为我们揭开了冰山一角。

为了探寻答案，研究团队展开了一项系统性研究。他们首先整合了多组学数据，筛选出具有编码潜力的lncRNA MUC20-OT1作为候选对象。随后，通过构建融合报告基因质粒、质谱分析和免疫印迹等技术，确证了其编码一个新型微蛋白，并将其命名为MUCP1。进一步的细胞分馏和免疫荧光实验揭示了MUCP1定位于线粒体外膜。为了探究MUCP1的生物学功能，研究人员运用了包括细胞增殖与侵袭实验、异种移植瘤模型在内的功能学分析。同时，他们通过非靶向和靶向代谢组学、稳定同位素¹³C₅-谷氨酰胺示踪、亚细胞琥珀酸定量等技术，深入剖析了MUCP1对细胞代谢的影响。此外，研究还采用了CUT&Tag和染色质免疫共沉淀-定量PCR(ChIP-qPCR)等技术，来探究MUCP1是否通过表观遗传机制发挥作用。免疫共沉淀(Co-IP)与质谱联用则被用于寻找MUCP1的相互作用蛋白。本研究使用的CRC细胞系和患者配对肿瘤组织样本均来源于公共库或南京医科大学附属南京第一医院，并经伦理委员会批准。

研究结果

1. 1.
   鉴定CRC中具有编码潜力的lncRNA
   通过对公共核糖体测序数据的整合分析，并结合编码潜力评分（phyloCSF和CPAT），研究人员将目光锁定在lncRNA MUC20-OT1上。生物信息学分析显示，其潜在的编码产物与琥珀酸脱氢酶黄素蛋白亚基(Succinate Dehydrogenase Flavoprotein Subunit A, SDHA)具有高度序列相似性，暗示其可能参与代谢调控。
2. 2.
   lncRNA MUC20-OT1编码一个微蛋白
   研究人员通过构建绿色荧光蛋白(GFP)和FLAG标签的融合质粒，并突变其预测的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)起始密码子进行对照实验，在细胞中成功验证了MUC20-OT1能够翻译产生一个微蛋白。他们进一步利用CRISPR/Cas9技术在基因组水平实现了对该蛋白C端的FLAG标签内源敲入，最终确证了这个由144个氨基酸组成的新型微蛋白的存在，并将其命名为MUCP1。
3. 3.
   MUCP1是定位于线粒体外膜的内源蛋白
   细胞分馏实验和免疫荧光共定位分析表明，MUCP1特异性地定位于线粒体。进一步的蛋白质酶K消化实验和碳酸钠提取实验证实，MUCP1是一个整合在线粒体外膜上的蛋白。在多种CRC细胞系和临床肿瘤组织中，MUCP1的表达水平均显著高于正常对照。
4. 4.
   MUCP1作为致癌微蛋白维持CRC进展
   功能实验表明，敲低MUCP1能显著抑制CRC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。而在MUCP1敲低的细胞中重新导入有功能的MUCP1（而非起始密码子突变体），则可以回救这些恶性表型。动物实验也证明，稳定敲低MUCP1的CRC细胞形成的移植瘤生长受到明显抑制。这些结果说明MUCP1本身具有促进肿瘤的致癌功能。
5. 5.
   MUCP1缺失破坏CRC细胞的代谢稳态
   代谢组学分析发现，敲低MUCP1导致细胞内谷氨酰胺及其衍生物、以及琥珀酸等三羧酸循环(TCA cycle)中间产物的水平显著下降，同时细胞对培养基中谷胱甘肽等物质的摄取增加。稳定同位素示踪显示，MUCP1缺失严重削弱了谷氨酰胺注入TCA循环的通量。这表明MUCP1对维持CRC细胞，尤其是谷氨酰胺代谢稳态至关重要。
6. 6.
   MUCP1缺失通过降低琥珀酸驱动的H3K4me3修饰抑制谷氨酰胺利用
   机制探索发现，MUCP1敲低导致细胞内特别是线粒体外琥珀酸水平下降，并伴随组蛋白H3第4位赖氨酸的三甲基化(H3K4me3)修饰水平降低。CUT&Tag和ChIP-qPCR分析证实，关键谷氨酰胺代谢酶（如GLS1, GLUL）以及MUC20-OT1自身基因的启动子区H3K4me3修饰富集度下降。补充可穿透细胞的琥珀酸类似物（二乙基琥珀酸，Diethyl Succinate, DES）或组蛋白去甲基化酶KDM5抑制剂KDOAM-25，可以恢复H3K4me3水平并促进谷氨酰胺摄取。这揭示了一条MUCP1-琥珀酸-H3K4me3-谷氨酰胺代谢基因转录的正反馈调控轴。
7. 7.
   MUCP1缺失导致琥珀酸在线粒体内积累
   对线粒体和胞质组分的分别定量显示，敲低MUCP1后，琥珀酸在线粒体内异常积累，而胞质琥珀酸减少。动态监测发现，这种线粒体琥珀酸淤积与细胞内谷氨酰胺的消耗下降在时间上相关联，提示MUCP1功能缺失损害了线粒体琥珀酸的外排。
8. 8.
   MUCP1对琥珀酸水平敏感并与SLC25A10协同调控琥珀酸稳态
   免疫共沉淀实验鉴定出线粒体内膜琥珀酸转运蛋白SLC25A10是MUCP1的相互作用蛋白。两者在表达上相互影响，功能上协同：敲低任一都会导致线粒体琥珀酸外排受阻、胞质琥珀酸减少和H3K4me3水平下降。有趣的是，MUCP1对胞内琥珀酸水平的波动反应更为迅速和敏感。当用DES增加胞质琥珀酸时，MUCP1和SLC25A10表达均上调；而当用抑制剂阻断琥珀酸转运或生成时，两者的蛋白水平则会下降。这表明MUCP1可能作为一个琥珀酸感受器，与SLC25A10协同工作，精细调节线粒体琥珀酸的转运以应对代谢需求。

研究结论与意义

本研究系统性地鉴定并验证了一个由lncRNA MUC20-OT1编码的全新微蛋白MUCP1。该蛋白在CRC中高表达，并定位在线粒体外膜。其核心功能是作为线粒体琥珀酸转运的辅助调节器，通过与内膜转运蛋白SLC25A10协作，促进线粒体基质中生成的琥珀酸向胞质运输。胞质琥珀酸的积累进而抑制组蛋白去甲基化酶活性，提高H3K4me3修饰水平，从而激活包括其自身基因MUC20-OT1在内的谷氨酰胺代谢相关基因的转录。这形成了一个正反馈循环：MUCP1促进琥珀酸外排和表观遗传激活，增强的谷氨酰胺代谢又为琥珀酸生成提供了底物，共同维持了CRC细胞的高代谢状态和恶性进展。

这项研究的重大意义在于多个层面：首先，它拓宽了人们对lncRNA功能的认识，证明其可通过编码功能性微蛋白直接参与肿瘤代谢调控。其次，它揭示了一种连接线粒体代谢、代谢物转运与核内表观遗传修饰的新型分子桥梁，即“MUCP1-琥珀酸-H3K4me3”轴，为理解肿瘤代谢重编程与表观遗传重塑的偶联机制提供了全新范式。最后，MUCP1在CRC中特异性高表达且对其代谢稳态至关重要，这使其成为一个极具潜力的诊断生物标志物和干预靶点。针对MUCP1或其调控通路，未来可能开发出基于代谢脆弱性的新型结直肠癌治疗策略。该研究启示我们，基因组中仍大量存在的未注释微蛋白，是发现癌症关键调控因子和疗法新靶点的宝贵资源。