根据文章标题“Balancing Barcoding and Genomics: gDNA Quality in Insect Vouchers After HotSHOT DNA Extraction”和摘要内容，一个有专业性且吸引人、能表明研究意义的中文标题为： 中文标题 平衡条形码测序与基因组学：HotSHOT DNA提取后昆虫凭证标本的基因组DNA质量评估

《Molecular Ecology Resources》：Balancing Barcoding and Genomics: gDNA Quality in Insect Vouchers After HotSHOT DNA Extraction

本研究评估了HotSHOT快速DNA提取法对后续昆虫基因组DNA（gDNA）的影响，证实了该法在批量条形码（barcoding）测序后，标本内仍保留可用于基因组学分析的gDNA。研究强调，野外储存条件（如马来氏陷阱Malaise trap）是影响DNA完整性的关键因素，并提供了优化HotSHOT处理与储存的指南，为利用稀有标本进行下游分析（如克服达尔文、赖因凯尔等生物多样性缺口）提供了关键技术支持。

　　

引言：两步法工作流程的挑战与机遇

在生物多样性大规模研究中，马来氏陷阱（Malaise trap）等批量采样方法能一次性收集成百上千个物种的标本。然而，对每个个体进行全基因组DNA提取和测序既不高效也不经济，且会因产生物理凭证和DNA提取物两份存档而导致“双凭证问题”。因此，一种“反向工作流程”应运而生：首先利用条形码（barcoding）对所有标本进行快速物种鉴定与分选，随后仅针对选定的标本进行目标基因组学分析。这一流程能够有效应对林奈、华莱士和普雷斯顿等生物多样性缺口。

该流程的一个关键前提是，在完成条形码提取后，凭证标本内仍需保留足够质量和数量的基因组DNA（gDNA），以供后续基因组分析。其中，热氢氧化钠和Tris（HotSHOT）提取法因其快速、廉价且能保存标本形态而广受欢迎。然而，HotSHOT处理是否会影响标本内gDNA的完整性，使其无法用于下游基因组学分析，此前尚不明确。

材料与方法：评估HotSHOT的影响

研究通过两个实验评估HotSHOT的影响。第一个为对照实验，使用新鲜采集的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster，双翅目）和一种朽木甲（Myllaena dubia，鞘翅目），测试了不同强度的HotSHOT处理（从室温处理到标准高温处理）对标本内gDNA质量和数量的影响，并使用QIAgen DNeasy Blood and Tissue Kit及MagAttract HMW DNA Kit进行gDNA提取。第二个实验模拟了野外条件，将来自9个科的昆虫标本置于装有70%乙醇的马来氏陷阱收集瓶中，在热带户外环境存放一周，然后比较经过与未经过标准HotSHOT处理的标本的gDNA质量与数量。DNA质量通过Qubit测量浓度，并通过Agilent Genomic DNA ScreenTape评估DNA完整性指数（DIN）和片段长度分布。

结果：HotSHOT与储存条件的双重影响

在对照实验中，HotSHOT处理的强度显著影响了HotSHOT提取液（hsDNA）中的DNA产量，标准处理“E”（65°C 18分钟加98°C 2分钟）产量最高。然而，令人惊讶的是，尽管hsDNA产量增加，但从经过HotSHOT处理的标本中提取的gDNA总量并未因高温暴露时间的增加而显著减少。不过，DNA质量却受到显著影响。未经处理的对照标本DNA完整性指数最高，而即使短暂的室温HotSHOT暴露也会导致DIN值下降，标准处理“E”导致的DIN值最低。此外，角质化程度较轻的果蝇比角质化较重的朽木甲对最强烈的HotSHOT处理更为敏感，其DIN值下降更显著。

片段大小分布提供了补充视角。对照标本中含有大量超过10 kbp的高分子量gDNA片段。HotSHOT处理“E”几乎消除了所有超过10 kbp的片段，使大多数gDNA片段长度集中在1-5 kbp范围。尽管如此，所有HotSHOT处理下，细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因658 bp条形码片段的PCR扩增均成功，表明用于测序的模板DNA充足。

在模拟马来氏陷阱条件的实验中，研究有了更关键的发现：标本在热带野外条件下存放一周，其gDNA已发生严重降解，片段主要集中在300 bp至5 kbp之间。因此，后续再施加标准的HotSHOT处理“E”所造成的进一步损伤相对有限，因为长片段DNA已所剩无几。实验数据显示，对于这些样本，HotSHOT处理前后的平均DIN值差异并不显著。

讨论：平衡条形码效率与基因组学潜力

综合结果表明，经HotSHOT处理的标本保留了足够用于下游基因组学分析的gDNA，其产量完全满足常用Illumina等短读长测序建库试剂盒的输入要求。这表明，基于HotSHOT进行条形码测序以分选分子操作分类单元（mOTU）的两步法工作流程，完全能够为后续利用短读长技术开展的基因组学研究提供合格的gDNA。这为解决达尔文、赖因凯尔、哈钦森和埃尔顿等需要基因组数据的生物多样性缺口带来了希望。

研究证实，昆虫标本gDNA的完整性强烈依赖于保存和储存历史。马来氏陷阱样本暴露于热带野外条件所造成的DNA降解程度，与博物馆标本经历多年缓慢降解后的情况类似。虽然这种降解水平不阻碍基于短读长的基因组分析，但严重限制了其在长读长测序和^{de novo}基因组组装等应用中的可用性。

为了最大化从批量样本中获取信息，应在第一步DNA浸提时尽量减少损伤。尽管文献中使用多种温度方案，但此前并未有研究尝试优化HotSHOT处理中的温度暴露。本研究表明，最强烈但最流行的处理“E”能释放最多的DNA，但代价是DNA完整性严重下降；而较温和的处理（如“B”）则能在产出足够条形码测序用DNA的同时，更好地保留用于基因组工作的长片段。幸运的是，HotSHOT提取走的DNA量非常少，并不会显著影响后续从标本中获取足量gDNA的可能性。

研究还发现，标本的生物学特性（如角质化程度）会影响HotSHOT的处理效果，这意味着不存在一个适用于所有标本的通用最优方案。未来的解决方案可能包括结合自动化分选系统与人工智能预测模型，根据标本性状（如角质化程度）为其分配合适的HotSHOT处理参数，从而在条形码测序效率与下游基因组分析潜力之间取得最佳平衡。

总而言之，基于条形码对标本进行分类，可以直接应对林奈、华莱士和普雷斯顿生物多样性缺口。而要应对达尔文、赖因凯尔、哈钦森和埃尔顿缺口，则需要对凭证标本进行基因组测序。通过减少标本在野外的暴露时间、优化储存条件以及根据分类群定制HotSHOT处理方案，可以进一步优化这一流程。尽管样本量和测试的野外条件有限，但本研究提供了切实的证据，表明HotSHOT法非常适合用于对批量生物多样性样本进行全面的、两步法的整体研究。