《New Biotechnology》：Reporter based screening identifies small molecule CBL0137 as an enhancer of CRISPR cytosine base editor and prime editor via p53 activation and NF-κB inhibition
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为解决CRISPR胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和先导编辑器（PE）在难编辑位点效率低下的难题，研究人员利用CBE响应的GFP报告系统高通量筛选了174个靶向DNA损伤、细胞周期和凋亡通路的小分子。他们鉴定出CBL0137可显著提升CBE的内源位点编辑效率（最高达80%），并选择性增强PE介导的多点突变和片段插入。该研究为通过调控细胞通路（p53/NF-κB）选择性增强基因编辑工具效率提供了新策略，提升了其治疗转化潜力。
在基因治疗和生命科学研究领域，CRISPR/Cas9系统及其衍生物——碱基编辑器（Base Editors, BEs）和先导编辑器（Prime Editors, PEs）——带来了革命性的变化。它们能够在不引入DNA双链断裂的情况下实现精准的基因组编辑，极大地降低了因DNA断裂导致的染色体异常等风险，为治疗遗传病带来了前所未有的希望。然而，这些“基因剪刀”的“编辑效率”却参差不齐，特别是在一些染色质结构致密、难以接近的基因组位点，编辑成功率常常不尽如人意，成为其走向临床应用的“卡脖子”难题。为了提高效率，科学家们尝试了多种方法，包括改造编辑器本身或利用小分子药物来调控细胞内的修复机制。那么，是否存在一种“增效剂”，能够安全、有效地提升这些编辑工具在难治位点的表现呢？
由Yun Hu、Yanhong Wang、Siyuan Wang、Yaoge Jiao、Rui Tao、Shaohua Yao（通讯作者）组成的四川大学华西医院研究团队在《New Biotechnology》上发表的研究，给出了一个肯定的答案。他们通过巧妙的实验设计，筛选出一种名为CBL0137的小分子化合物，发现它能够通过激活著名的“基因组守护神”p53通路并抑制炎症相关通路NF-κB，来选择性且显著地增强特定类型的基因编辑，为解决编辑效率瓶颈提供了全新的策略。
为了开展这项研究，作者团队主要运用了几项关键技术。首先，他们构建了一个巧妙的“基因编辑效率传感器”——基于Tol2转座子系统的稳定整合GFP报告细胞系（eGFP(202S)-293T）。这个报告系统包含一个因点突变而失活的绿色荧光蛋白（eGFP），只有当CBE成功将其纠正回正常序列时，细胞才会发出绿色荧光，从而实现对CBE活性的快速、定量、高通量检测。利用该系统，他们对一个包含174个小分子的内部化合物库（靶向DNA损伤、细胞周期和凋亡通路）进行了筛选。其次，研究广泛使用了下一代测序（NGS）和桑格测序，对内源性基因组位点的编辑效率、产物纯度（如C-to-T与C-to-G的比例）以及脱靶效应进行了精准量化。此外，为了探究机制，他们使用了特定的通路激动剂（如Nutlin-3a、Tenovin-6）和抑制剂（如BAY11-7082、BAY11-7085），并结合了过表达显性负性p53突变体等分子生物学手段，来剖析CBL0137的作用机理。最后，研究还采用了正交R-loop实验来评估Cas9非依赖性的脱靶编辑。
研究结果
2.1. 高通量筛选鉴定出增强CBE的候选小分子
研究人员构建了可由CBE激活的GFP报告系统，并建立了稳定的报告细胞系eGFP(202S)-293T。利用该系统对174个小分子进行筛选后，发现CBL0137的效果最为显著，能将报告系统的编辑信号增强约5.5倍。剂量优化实验确定其最佳工作浓度为0.5 μM，能在有效增强编辑的同时保持细胞活力。
2.2. CBL0137增强内源位点CBE的效率和纯度
在HEK293T细胞中，CBL0137处理能显著提高BE3在9个内源靶点中7个位点的C-to-T编辑效率，平均提升约50%。同时，它还明显降低了不纯的C-to-G编辑产物。在包括异染色质区域（如NF1）、高甲基化位点（MSSK1）和治疗相关靶点（如HBG1/2）在内的6个难编辑位点，CBL0137也一致性地提高了编辑效率，平均提升约40%。这种增强效果在其他CBE变体（BE3-A3A, BE3-AID）以及其他细胞系（HeLa, LO2）中也得到验证。此外，结构类似的化合物奎纳克林（quinacrine）也表现出类似的增强C-to-T、降低C-to-G的效果。与已报道的组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）Nexturastat A相比，CBL0137的增强效果相当，两者联用可进一步优化编辑结果，获得最高的C-to-T纯度和编辑效率。脱靶分析表明，CBL0137会轻度增加Cas9依赖的脱靶编辑，但不影响Cas9非依赖的脱靶编辑。
2.3. p53激活和NF-κB抑制共同贡献了CBL0137对CBE的增强作用
机制研究表明，CBL0137是一种多靶点化合物，已知可通过靶向FACT复合物来激活p53并抑制核因子κB（NF-κB）。通过使用p53通路激活剂（Nutlin-3a, Tenovin-6）和NF-κB通路抑制剂（BAY11-7082, BAY11-7085），研究人员发现单独激活p53或抑制NF-κB均能增强CBE效率。而过表达显性负性p53突变体（p53 R175H, p53 DD）则会抑制CBE效率。联合使用p53激活剂和NF-κB抑制剂的效果优于单一化合物。这些结果证实，p53激活和NF-κB抑制共同介导了CBL0137对CBE的增强作用。
2.4. CBL0137对其他碱基编辑器的影响
研究评估了CBL0137对其他类型碱基编辑器的影响。结果发现，它对腺嘌呤碱基编辑器（ABE）的效率有轻微降低或没有影响。对于依赖于脱嘌呤/脱嘧啶（AP）位点修复的编辑器，如腺嘌呤颠换编辑器（AYBE）、基于糖基化酶的鸟嘌呤碱基编辑器（gGBE）和C-to-G碱基编辑器（CGBE），CBL0137的影响因位点而异，总体表现为效率轻微下降或无显著变化。这表明CBL0137的作用具有编辑类型和位点特异性，提示不同碱基编辑诱导的DNA损伤可能通过不同机制修复。
2.5. CBL0137对各类先导编辑的影响
令人惊讶的是，CBL0137对PE的影响呈现出选择性。它轻微降低了PE介导的单点突变效率，但却显著增强了PE介导的多点突变（提升19%-205%）和小片段插入（提升54%-266%）的效率，而对片段删除的效率影响不明确。这种增强效果在LO2细胞中也得到重复。机制上，p53激活剂和NF-κB抑制剂同样能增强PE的多点突变和片段插入效率，说明CBL0137对PE的增强也通过相同通路实现。研究人员推测，PE介导的插入和删除可能产生不同的DNA中间体，从而招募不同的修复因子，导致CBL0137产生差异化的效果。
研究结论与意义
本研究成功建立了一个高效的CBE报告系统，并利用其筛选出小分子化合物CBL0137作为CBE和特定类型PE的强效增强剂。CBL0137不仅能提升CBE的编辑效率和产物纯度，其效果与已知的增强剂Nexturastat A相当，两者联用更能协同优化编辑结果。更重要的是，研究发现CBL0137能选择性增强PE介导的多点突变和片段插入，这为需要同时修正多个突变或插入治疗性基因片段的疾病（如某些遗传病）提供了新的工具优化思路。
研究的核心发现是，CBL0137通过激活p53通路和抑制NF-κB通路来发挥增强作用。值得注意的是，在HEK293T等体细胞中，p53的激活促进了编辑，这与之前在诱导多能干细胞（iPSCs）中的研究发现（抑制p53可增强编辑）相反。这凸显了p53通路在响应DNA损伤时具有细胞类型特异性的功能，为未来针对不同细胞类型设计编辑增强策略提供了重要见解。
此外，CBL0137对CBE有增强作用，但对结构相似仅缺少尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂（UGI）的CGBE影响甚微，提示其增强作用依赖于内源UNG活性，可能通过p53调控的DNA修复网络来实现。而对PE编辑类型的选择性增强则暗示，不同长度和类型的PE编辑可能产生结构各异的DNA中间体，并经由不同的修复通路完成，CBL0137对这些通路的影响存在差异。
综上所述，该工作不仅为提高CBE和PE的编辑效率提供了一种实用的小分子策略，有望推动这些下一代基因编辑工具的临床转化，还为了解不同基因组编辑器所诱导DNA损伤的修复机制提供了新的线索。通过操控p53和NF-κB这类关键的细胞信号通路来“定制化”增强基因编辑，代表了一条极具潜力的研究方向。
