1. 文章中文标题 中文标题 GTP结合态Ran GTPase中构象开关I的诱导性开放：揭示一种新的失活机制与潜在癌症治疗靶点

《Protein Science》：Induced opening of conformational switch I in GTP-bound Ran GTPase

语 本研究发现，GTP结合态Ran（一种调控核质运输的小GTP酶）中的构象开关I可从关闭的活性状态转变为完全开放的失活构象。这一过程需要两个关键相互作用被破坏：Thr42与Mg2+离子的配位（导致部分开放构象，即“状态1”）以及Phe35–GTP–Lys152三元复合体（因Lys152重排而瓦解）。研究揭示了Lys152在稳定Ran活性构象中的关键作用，并指出这种构象转换机制可能为靶向突变导致开关I被锁定于活性状态的癌症等疾病提供新的治疗思路。

　　

5. 文章内容归纳总结

1 引言

Ran是一种属于Ras超家族的小GTP酶，是核质输入/输出的主要调控因子。与其他小GTP酶类似，它在无活性的GDP结合状态和有活性的GTP结合状态之间循环。其核苷酸交换和水解速率分别受鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）和GTP酶激活蛋白（GAP）调控。Ran的功能依赖于其调节因子的空间分布：RanGEF（染色体凝聚蛋白1， RCC1）局限于细胞核，而RanGAP则局限于细胞质，这种分离在核孔复合体（NPC）两侧建立了RanGTP浓度梯度。核运输因子2（NTF2）促进RanGDP进入细胞核，并在核内被RCC1催化生成RanGTP。RanGTP随后驱动输出蛋白（exportin）结合的货物分子和核运输受体（NTRs）返回细胞质，并在细胞质中被RanGAP水解回RanGDP。

Ran的结构包含一个G结构域（GTP结合结构域）和一个独特的C末端螺旋。在GDP结合状态，C末端与G结构域结合；而在GTP结合状态，它则从G结构域上解离。G结构域的功能关键元件包括磷酸结合环（P-loop，与Mg²⁺离子共同稳定核苷酸结合）以及构象开关I（switch I）和开关II（switch II），它们在GDP/GTP交换时发生主要的构象变化，从而调控核运输受体的货物装卸。

本研究旨在探索RanGTP中开关I从闭合活性形式（状态2）向类似RanGDP完全开放失活构象转变的诱导性构象变化机制。

2 结果与讨论

2.1 Phe35–GTP–Lys152三元体的功能意义

在一项名为md1的分子动力学（MD）模拟中，RanGTP的开关I发生了从闭合到开放的巨大构象变化，其开放构象与RanGDP中观察到的构象非常相似。为了表征这一开放运动，研究人员监测了开关I残基与GTP之间的距离变化。在模拟的前114纳秒，只有Phe35和Glu36残基与GTP保持持续接触；这些相互作用在大约114纳秒时减弱，恰逢开关I开始打开。Phe35芳香环中心与GTP鸟嘌呤部分中心之间的距离，以及Glu36:O与GTP:O2′/O3′之间的氢键距离均急剧增加，标志着开关I从G结构域上解离。

相比之下，在开关I保持闭合构象的md2模拟中，这些距离在整个模拟时间内保持稳定。为了进一步研究并尝试重现开关I的闭合-开放构象转变，研究人员从md1轨迹的103纳秒结构（开关I打开前几纳秒）启动了一系列独立的MD模拟。在七个模拟中，仅在一个名为md1′的轨迹中观察到了开关I的开放。

2.2 三元体破坏的结构基础

在md1′模拟中，距离分析显示，首先观察到Phe35_ringCOM—GTP_guanineCOM之间的距离增加（约43纳秒），随后是Glu36与GTP的解离（约191纳秒）。尽管发生了这些变化，开关I在此阶段仍保持闭合构象。在这种闭合的RanGTP构象中，GTP的鸟嘌呤碱基与Phe35的芳香环发生边对面π-π相互作用，该相互作用通过Phe35与Lys152侧链脂肪族部分之间的疏水接触得到进一步稳定，从而形成了Phe35–GTP–Lys152三元体。这个三元体的疏水相互作用将开关I锚定在闭合状态，额外的稳定作用则由Glu36与GTP之间的氢键提供。

随后，Phe35芳香环中心与Lys152侧链疏水碳原子中心之间的距离急剧增加，表明三元体被破坏，导致开关I从GTP上解离。总体而言，分析表明开关I的闭合到开放转变需要Phe35–GTP–Lys152三元体和Glu36–GTP氢键两者均被破坏。

2.3 Mg²⁺配位的重排

研究发现，Glu186向Lys152靠近导致盐桥形成。这一新的相互作用将Lys152的疏水侧链从三元体中置换出来，从而破坏了三元体并最终触发了开关I的打开。

鉴于RanGTP md1模拟中C末端的位置与RanGDP晶体结构中观察到的位置非常相似，研究人员进行了三个平行的RanGDP模拟进行比较。结果表明，在所有三个RanGDP模拟中，开关I都保持开放构象，其开放程度与md1′RanGTP中观察到的相当。此外，在所有RanGDP模拟的整个持续时间内，Lys152和Glu186都保持持续接触，表明它们在维持开关I开放构象中起作用。

图4提供了RanGTP从闭合到开放状态构象转变的结构总结。在闭合构象中，开关I由Phe35–GTP–Lys152三元体和Glu36与GTP之间的氢键稳定。在中间状态，Glu186-Lys152盐桥的形成置换Lys152侧链，导致Phe35芳香环远离GTP并伴随Glu36-GTP氢键的破坏。这些变化逐渐使开关I失稳，最终导致开放状态，此时开关I完全从G结构域上解离。

2.4 诱导开关I的完全开放构象

在那些开关I保持闭合构象的模拟中，观察到Glu36–GTP氢键的暂时性破坏，而Phe35–Lys152–GTP三元体保持稳定。被保留的三元体稳定了开关I的闭合状态，但允许开关II邻近区域的灵活性增加。在极少数情况下，例如在最初的md1模拟中，如果Phe35环的翻转发生在Glu36–GTP氢键被破坏的构象中，Phe35的翻转会在没有扰动Lys152的情况下破坏三元体，导致开关I打开。

研究人员检查了Mg²⁺配位情况。在报告的大多数RanGTP模拟中，Mg²⁺—Thr42:OG1的距离超过了4埃，表明Thr42从Mg²⁺配位球中被置换出来。这种重排发生在能量最小化之后，带负电荷的Asp65进入了Mg²⁺配位球，置换了一个配位水分子，导致Mg²⁺暂时形成七配位几何，偏离其首选的对称八面体几何，这可能导致了局部结构不稳定。这种扭曲最终随着Thr42退出配位球而得到缓解，从而导致开关I的部分开放。

2.5 Ran相对于Ras的开关I重排

研究模拟表明，仅破坏Mg²⁺配位会导致开关I部分开放构象，主要影响靠近GTP三磷酸链的区域。这与Ras–GTP复合物中报道的结构特征一致。在这些结构中，Mg²⁺配位的Thr35（相当于Ran中的Thr42）被突变，从而破坏了Mg²⁺与开关I的相互作用。尽管部分开关I向外移动，但Ras的Phe28–GTP–Lys147三元体保持完整，产生了部分开放构象，被称为“状态1”（开放的、效应子非结合形式），区别于“状态2”（闭合的、效应子结合构象）。

研究结果进一步表明，只有当Mg²⁺配位和Ran的Phe35–GTP–Lys152三元体均被破坏时，才能实现像RanGDP晶体结构中那样的完全开放开关I构象。Mg²⁺配位的丧失可由GAP活性触发；在模拟中，三元体的破坏是由Lys152向Glu186的重排驱动的。将Ran–Ras比较扩展到，Ran中的Glu186在Ras中不存在，这意味着Ras的三元体不会从Lys147一侧（相当于Ran中的Lys152）失稳。然而，实验证据表明，H-Ras在缺少核苷酸的情况下也能采用完全开放的开关I构象，尽管这些情况中H-Ras都与SOS形成复合物，这可能有助于开关I的打开，此时三元体的破坏是由于缺少核苷酸。

由于开关I构象的自发开放很罕见，Ran结合伴侣如何促进这一转变仍有待阐明。一方面，Thr42–Mg²⁺相互作用的丧失是GAP诱导效应的既定结果。从Phe35–GTP–Lys152三元体方面来看，Ran与RanBP1和RanBP2的Ran结合域复合物的X射线结构显示，Phe35可能与这些效应子接触，表明伴侣结合可以调节三元体的稳定性。同时，Lys152已被鉴定为体内SUMO（类泛素修饰）的接受位点，RanBP2的SUMO-E3连接酶区域可以在该残基附近与Ran结合。这些相互作用可能提供了破坏三元体的合理途径，并表明伴侣结合或翻译后修饰可以创造诱导本研究中描述的开关I开放机制所需的条件。

3 结论

本研究利用分子动力学模拟揭示了RanGTP中开关I开放的机制。研究结果表明，完全转变为开放的开关I构象需要两个扰动：（i）破坏Phe35–GTP–Lys152三元体，这是通过Lys152与Glu186相互作用导致的重排而启动的；（ii）将Thr42从Mg²⁺配位球中置换出来。这些变化反过来也破坏了Glu36与GTP之间的氢键，使开关I能够转变为类似于RanGDP失活状态的开放构象。

总之，这些发现定义了开关I从“开”到“关”转变的新机制基础，并为调控因致病性突变稳定了活性状态的小GTP酶（尤其是在癌症中）指出了潜在的治疗策略。