《The Plant Genome》：Genomic selection of root-knot nematode (Meloidogyne enterolobii) resistance in watermelon wild relatives (Citrullus amarus)
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本文聚焦于对西瓜（Citrullus lanatus）生产构成严重威胁的入侵性根结线虫（Meloidogyne enterolobii）。为应对这一挑战，研究利用基因组选择（Genomic Selection, GS）策略，对西瓜野生近缘种Citrullus amarus的97份种质资源进行了抗性评估。研究基于全基因组重测序获得的210万个单核苷酸多态性（SNP）标记，比较了包括基因组最佳线性无偏预测（GBLUP）、稀疏GBLUP（sGBLUP）和再生核希尔伯特空间（RKHS）回归在内的多种基因组预测模型。结果表明，基于全部SNP的RKHS模型对根结线虫诱导的根结（galling）和每克根卵数（eggs per gram root）具有最高的预测能力，并成功筛选出多个高抗性种质。本研究为利用基因组选择技术将C. amarus中的多基因抗性高效导入栽培西瓜品种，培育持久抗性新品种提供了有效策略和宝贵遗传资源。
1 引言
西瓜（Citrullus lanatus）是全球重要的经济作物。然而，集约化耕作和土壤熏蒸剂甲基溴的淘汰，使得根结线虫（Root-Knot Nematode, RKN）的危害日益加剧。其中，根结线虫新小种Meloidogyne enterolobii因其强致病性和克服作物抗性的能力，对西瓜及其他蔬菜作物构成了重大威胁。所有商业西瓜品种对RKN高度感病，田间条件下可能导致50%-75%的产量损失。此外，RKN侵染还能与尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）产生协同效应，加剧枯萎病和产量损失。目前的化学防治和农艺措施存在局限，因此，培育抗性品种成为最可持续的长效解决方案。
西瓜野生近缘种Citrullus amarus（citron melon）被鉴定为RKN抗性的宝贵来源。然而，由于该抗性为多基因控制的复杂数量性状，利用传统数量性状位点（QTL）作图和标记辅助选择（MAS）难以将众多分散的微效基因位点有效导入栽培种背景。基因组选择（Genomic Selection, GS）通过利用全基因组标记信息预测未测试个体的遗传潜力，为复杂性状的高效选育提供了有前景的解决方案。本研究旨在利用已有的表型和基因组数据，评估不同GS模型预测M. enterolobii抗性的性能，并基于基因组估计育种值（Genomic Estimated Breeding Value, GEBV）从C. amarus种质中筛选候选基因型，以用于旨在提高西瓜品种RKN抗性的育种计划。
2 材料与方法
2.1 RKN抗性表型鉴定
研究使用的根结百分比和每克根卵数表型数据来源于前期一项全基因组关联分析（GWAS）。在2021年夏季和秋季，在温室中对108份C. amarus自交系种质（Plant Introduction, PI）及感病对照“Charleston Gray”进行了四轮表型鉴定。实验采用完全随机设计，用4000个M. enterolobii卵接种幼苗，接种六周后评估根结和线虫繁殖情况。卵的提取采用Hussey和Barker的方法。抗性阈值设定为根结率<50%和每克根卵数<7000。
2.2 基因分型
基因组数据来源于C. amarus种质的全基因组重测序。使用Illumina NovaSeq 6000平台测序，读数比对至C. amarus参考基因组（USVL246-FR2）。变异调用采用GATK Best Practices流程，并基于质量、缺失数据、次要等位基因频率（Minor Allele Frequency, MAF）和测序深度对单核苷酸多态性（SNP）进行过滤。
2.3 统计分析
统计分析在R语言中进行。根据与感病对照相比根结和线虫繁殖的显著减少情况，将材料分为感病、中间型和抗病。为了评估种质资源内的表型变异，为根结百分比和每克根卵数两个性状生成了直方图。
2.4 遗传参数计算
为确定C. amarus种质中M. enterolobii抗性的遗传模式，估算了根结和每克根卵数的广义遗传力（H2）和狭义遗传力（h2）。广义遗传力使用表型数据估算，狭义遗传力基于基因组关系矩阵（G矩阵）计算，均使用了ASReml-R软件包。
2.5 表型数据分析
采用线性混合模型计算抗性性状的经验最佳线性无偏估计（eBLUEs）。模型考虑了重复效应，从每次重复中估算的每个抗性家系的eBLUEs随后用于计算基因组预测模型的预测能力。
2.6 基因组预测模型
使用四种统计模型进行基因组预测（Genomic Prediction, GP）分析：基因组最佳线性无偏预测（GBLUP）、稀疏GBLUP（sGBLUP）、再生核希尔伯特空间（RKHS）回归和稀疏RKHS（sRKHS）。采用重复10次的10折交叉验证方案来评估预测能力。GBLUP和sGBLUP模型使用rrBLUP和AGHmatrix软件包实现，以计算加性基因组关系矩阵。RKHS模型使用BGLR软件包实现，其中基因组核通过标准化标记矩阵的内积计算。稀疏模型基于从所有标记中挑选出的方差最高的前10,000个SNP。
2.7 模型评估
由于根结百分比与每克根卵数之间相关性较弱，本研究仅测试了处理单一变量的单变量模型。通过观察值与预测值之间的皮尔逊相关性，并采用10折交叉验证方案来评估GP模型。交叉验证过程重复10次，最终模型评估指标为所有折和重复的平均相关性。
2.8 用于捕获优良基因型的选择强度
基于基因组估计育种值，对两个性状分别应用了10%、20%和30%三种选择强度，以识别优良基因型。将基于RKHS（210万个标记）的GEBV结果与基于eBLUEs的家系排名进行比较，以评估选择的一致性并确定表现最佳的基因型。在针对M. enterolobii抗性进行表型鉴定的108份种质中，只有97份同时拥有两个性状的表型和基因型数据，用于下游分析。
3 结果
3.1 根结严重程度和线虫繁殖在种质间的分布
C. amarus种质间的根结百分比呈现连续分布，大多数基因型的根结组织集中在10%-40%范围内。另一方面，每克根卵数呈偏态分布，约78.17%的基因型其卵数低于整个种质资源库的平均值。感病对照品种Charleston Gray高度感病，平均根结率为77.11%，平均每克根卵数为84,382.86。
3.2 遗传力估计
根结的广义遗传力（H2）和狭义遗传力（h2）分别为0.69和0.23；每克根卵数的广义遗传力和狭义遗传力分别为0.47和0.46。对于每克根卵数，H2和h2值接近，表明加性遗传效应是表型变异的主要贡献者；而对于根结，则可能存在除加性效应外的其他效应，如显性或上位性。
3.3 基因组预测性能
评估的四种GP模型在两个抗性性状上表现出中等的预测能力，范围在0.30到0.50之间。对于根结百分比，sGBLUP和RKHS模型均达到最高的预测能力（0.42）。对于每克根卵数，使用全部标记的RKHS模型产生了最强的预测（预测能力=0.50）。在所有模型中，使用全部标记的RKHS模型对每克根卵数的均方根误差最低，表明其能更准确地近似观测表型。sGBLUP为根结预测提供了可比的预测能力，且因其计算效率高而具有吸引力。这些结果凸显了针对性状特异性选择模型的重要性。
3.4 选择强度对GEBV表现的影响
首先基于经验BLUEs模型，在不同选择强度下初步筛选了候选RKN抗性种质。接着，基于GEBVs，利用GS方法进一步筛选了最抗RKN的种质。正如预期，在更高的选择强度下，基于GEBV的选择比基于BLUEs的选择鉴定出的基因型更少。在10%选择强度下，基于BLUEs和GEBV的重叠，鉴定出五份对根结具有最高抗性的种质（PI 596692, PI 532664, PI 288316, PI 271767, PI 542118），以及三份对卵繁殖具有高抗性的种质（PI 271775, PI 485584, PI 299379）。然而，在10%或20%的选择强度下，没有发现任何种质能同时基于BLUEs和GEBV的重叠对根结和每克根卵数两个性状均表现出抗性。在30%选择强度下，PI 596676和PI 171392在基于BLUEs和GEBV方法的重叠筛选中，被一致地选为对根结和每克根卵数均具有抗性，凸显了它们作为提高西瓜品种两个RKN抗性成分（根结和每克根卵数）的供体潜力。
4 讨论
种质间抗性水平的分布反映了线虫繁殖的显著变异性，凸显了筛选高抗RKN的C. amarus基因型用于提高西瓜品种抗性的潜力。M. enterolobii根结百分比与每克根卵数分布模式的差异表明，这两个抗性性状由不同的基因位点控制。前期GWAS研究发现，与减少根结相关的QTL位于染色体Ca03上，而与减少每克根卵数相关的QTL分别位于染色体Ca04和Ca08上。因此，在将RKN抗性导入西瓜品种基因组背景的育种计划中，应考虑为每个性状单独制定选育策略。
与辣椒和番茄中存在与RKN抗性相关的主效基因不同，西瓜中的RKN抗性由多基因位点控制，其机制尚不完全清楚。由多基因位点控制的抗性被认为比由单基因控制的抗性更为持久。因此，尽管具有挑战性，但利用基因组选择将C. amarus种质资源中的多基因RKN抗性性状导入栽培种背景，对于培育具有持久抗性的西瓜品种具有长远价值。
本研究评估的GP模型中，RKHS模型为每克根卵数提供了最高的预测能力，为根结提供的预测能力与sGBLUP相当。这些结果证实RKHS模型非常适合捕捉复杂的性状遗传结构。使用1万个高方差SNP标记的稀疏GBLUP在根结预测上略有改进，但降低了每克根卵数的预测能力，凸显了标记密度与预测能力和计算效率之间的权衡。在不同选择强度下比较GEBVs与BLUEs表明，基于GEBV的选择在较低阈值时更为保守，但随着选择压力的增加，与表型选择越来越具有可比性，这表明这两个RKN抗性性状由不同的机制和基因位点控制。
5 结论
本研究证明了基因组选择作为提高西瓜RKN抗性育种工具的潜力。抗性由多基因位点控制，不同的抗性机制可能分别影响根结和每克根卵数。对根结和每克根卵数的中等遗传力估计支持了基于加性效应的模型在改良这些性状方面的适用性。在评估的模型中，RKHS模型为两个性状提供了最强的预测能力，证实了其在捕捉复杂遗传结构方面的价值。基于GEBV的选择在低选择强度下更为保守，但随着选择阈值的放宽，与表型选择的可比性增强，突显了其在育种计划中的实用价值。
未来，将基于本研究筛选的C. amarus基因型之间杂交产生的大型训练群体，并使用先进建模技术进行进一步评估，以捕获包括微效（加性）效应在内的大多数基因位点。此外，完善标记选择策略和整合机器学习方法可能会进一步提高预测准确性，加速RKN抗性西瓜品种的培育。
