《Phytomedicine》：Homoplantaginin ameliorates osteoarthritis by activating Sirt3/PINK1/Parkin signaling to promote mitophagy and attenuate inflammation in chondrocytes
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本研究通过建立骨关节炎（OA）动物模型和体外细胞模型，系统评估了黄酮苷Homo的治疗效果及分子机制。结果表明，Homo通过激活Sirt3-PINK1/Parkin自噬通路改善软骨细胞功能，抑制炎症和ECM降解，为OA治疗提供新策略。
张华|肖家聪|易彦芝|陈博浩|吕文雪|马继志|林宇彤|吴宇辰|孟凯|蔡玉丽|李刚|张正泽
中国山东省中医院附属医院骨科，济南
摘要
背景
骨关节炎（OA）是一种常见的关节疾病，其特征是软骨退化、半月板损伤和滑膜病变，给经济和社会带来了巨大负担。同植物素（Homo）是一种黄酮类糖苷，是传统草药Salvia plebeia R.Br.的主要活性成分，具有显著的抗炎和抗氧化作用。然而，其在治疗OA方面的潜力尚未得到充分探索。
目的
本研究旨在评估Homo在治疗OA中的疗效，并阐明其作用机制。
研究设计
通过结合体内和体外OA模型以及转录组分析、分子-蛋白质亲和力分析，我们确定了Homo在对抗OA中的保护作用机制。
方法
使用体内前交叉韧带切断（ACLT）小鼠模型和体外LPS诱导的软骨细胞模型来评估Homo的疗效。通过微CT和组织学分析来评估Homo对体内关节软骨或软骨下骨的保护作用。在体外实验中，通过CCK-8检测、凋亡分析、Western blot、实时定量PCR（RT-qPCR）和活性氧（ROS）染色来评估Homo对软骨细胞存活率、氧化应激和细胞外基质（ECM）代谢的影响。随后，通过转录组分析、分子对接、分子动力学模拟、细胞热位移测定（CETSA）和表面等离子共振（SPR）来确定Homo在OA中的潜在治疗靶点。此外，还利用Western blot、RT-qPCR、免疫荧光（IF）、JC-1染色和透射电子显微镜（TEM）来研究Homo对软骨细胞线粒体功能和自噬相关信号通路的影响。
结果
Homo在体内和体外实验中均显著缓解了OA相关的病理表现，表现为软骨退化减轻、ECM代谢正常化、软骨细胞存活率提高、凋亡抑制和氧化应激减轻。转录组测序显示自噬是Homo治疗作用的关键机制，同时Sirt3表达显著上调。通过分子对接、分子动力学模拟、CETSA和SPR分析，确定Sirt3是Homo的直接靶蛋白。进一步研究表明，Homo激活了Sirt3/PINK1/Parkin信号通路，从而促进自噬并恢复线粒体功能。最终，通过体内和体外实验验证了Homo通过靶向Sirt3缓解OA的疗效。
结论
本研究首次证明Homo能够改善软骨细胞稳态并减缓OA进展。我们发现Homo直接与Sirt3结合，从而激活下游的PINK1/Parkin信号通路并增强自噬。这一发现为OA的临床治疗提供了新的策略。
引言
骨关节炎（OA）是全球最常见的关节疾病，主要影响膝关节。该疾病表现为软骨损伤、半月板病变和滑膜病理改变，通常导致关节疼痛、肿胀、僵硬和功能障碍（Yao等人，2023年）。随着肥胖和老龄化趋势的加剧，预计未来二十年OA的全球发病率将上升约50%。到2050年，全球将有超过3.15亿人受到OA的影响，这对全球医疗保健体系和经济系统构成重大挑战（Latourte等人，2020年；Misseri等人，2024年）。目前尚无药物干预措施能够逆转或有效阻止OA的进展。临床管理策略主要集中在缓解症状上，而非修复受损的关节结构和功能（Voelker，2024年）。
软骨细胞作为关节软骨的唯一细胞成分，在维持软骨基质稳态和结构完整性方面起着关键作用（Zheng等人，2021年）。在OA进展过程中，软骨细胞出现表型异常，导致细胞外基质（ECM）降解和软骨退化（Deng等人，2024年）。病理变化表现为降解ECM的酶（如基质金属蛋白酶MMPs）水平升高，同时抑制II型胶原（COL2A1）和聚集蛋白等关键ECM成分的生成。这种软骨稳态失衡推动了OA向终末期病理的不可逆进展。
在生理条件下，软骨细胞在炎症信号刺激下会迅速激活自噬，清除受损的线粒体并抑制有害代谢物（如活性氧ROS）的过量产生（Lu等人，2025年）。这一过程同时调节关键ECM成分的表达，从而保持软骨组织的结构和功能完整性（Sun等人，2021年）。然而，在OA进展过程中，自噬过程失调，导致受损线粒体或有害代谢物的积累，进而引发软骨细胞凋亡，破坏ECM稳态并加速软骨退化。在自噬调节中，PINK1/Parkin通路起核心作用：线粒体受损时，PINK1在膜外积累并招募E3泛素连接酶Parkin，后者促进线粒体泛素化，将受损的细胞器隔离并进行自噬降解。但在OA软骨中，这种保护机制功能受损，导致有毒损伤相关物质的积累，从而加剧疾病进展（Sun等人，2021年）。
Sirtuin 3（Sirt3）是一种主要的线粒体去乙酰化酶，可调节100多种线粒体底物蛋白的乙酰化状态，包括超氧化物歧化酶2（SOD2）。这种调节增强了它们的抗氧化能力，减少了线粒体活性氧（mtROS）的产生，维持了线粒体内的氧化还原平衡，保护软骨细胞免受氧化应激损伤（Chen等人，2021年）。抑制软骨细胞中的Sirt3会引发线粒体缺陷并加速骨关节炎的进展，而Sirt3敲除小鼠模型表现出更严重的关节退化（Xu等人，2021年）。最新研究表明，Sirt3还通过调节PINK1/Parkin通路来影响自噬（Deng等人，2025年）。
同植物素（Homo）是传统草药Salvia plebeia R.Br.的主要活性成分（Li等人，2024年）。由于其显著的抗炎和抗氧化作用，Homo传统上用于治疗肝炎、咳嗽和腹泻等炎症性疾病（Liang等人，2020年）。最近的研究表明，Homo能够减轻由血脂异常和高血糖引起的内皮炎症（Fan等人，2023年；He等人，2016年；Meng等人，2022年）。此外，研究证实Homo通过抑制NF-κB/MAPK通路来减轻炎症反应和ECM降解（Li等人，2024年）。鉴于这些生物通路在OA发病机制中的关键作用，我们认为Homo的抗炎和抗氧化特性可能为OA治疗提供新的方法。
基于这些发现，我们假设Homo可以通过抑制炎症反应和调节ECM代谢来减缓OA的病理进展。为了验证这一假设，我们建立了前交叉韧带切断（ACLT）模型，并通过腹腔注射给予Homo。同时，使用脂多糖（LPS）模拟了体外软骨细胞炎症模型，系统研究其对软骨细胞功能和ECM代谢的影响。本研究旨在探讨Homo对OA的治疗效果，特别是其减轻炎症和保护软骨的能力。这些发现为其开发成新型OA治疗药物提供了基础证据。
实验材料
本研究使用的材料和试剂列于表S1中。
动物分组和处理
从广东医学实验动物中心获得了40只7周大的雄性C57BL/6J小鼠。所有动物均在SPF条件下饲养，并获得了广州中医药大学第一附属医院动物伦理委员会的批准（批准编号20250139；2025年1月10日）。适应一周后，将小鼠随机分为5组（每组8只）。
Homo在ACLT诱导的小鼠模型中缓解OA
为了评估Homo的体内疗效，我们通过ACLT手术建立了小鼠OA模型，实验流程如图1A所示。初步观察和组织学检查确认Homo在体内没有明显的毒性作用（图S1）。微CT成像显示ACLT诱导的小鼠胫骨平台区软骨下骨侵蚀明显，小梁骨体积减少，软骨表面不规则。
讨论
OA的主要特征是ECM退化和关节软骨炎症（Huang和Kraus，2016年；Rahmati等人，2017年）。为了评估Homo的疗效，我们首先通过ACLT手术建立了体内OA模型。微CT和组织学分析证实ACLT组出现了典型的OA病理变化，包括软骨结构破坏、软骨下骨丢失和小梁骨退化。Homo治疗显著缓解了这些症状。
结论
总之，本研究阐明了天然化合物Homo通过直接靶向Sirt3、激活下游PINK1/Parkin信号通路和促进自噬来改善软骨细胞稳态并减缓OA进展的分子机制（图11）。这些发现表明Homo是治疗OA的潜在有效候选药物。
资助
本研究得到了国家重点中医证候学研究生项目（SLKY2025A0002）和广州中医药大学研究生创新提升项目（A3-0317-25-429-008）的支持。
数据和材料的可用性
本研究生成或分析的所有数据均包含在本文及其补充材料中。
CRediT作者贡献声明
张华：撰写——初稿、方法学、数据分析。
肖家聪：撰写——审稿与编辑、方法学、数据分析。
易彦芝：撰写——审稿与编辑、可视化、方法学。
陈博浩：撰写——审稿与编辑、软件应用、方法学。
吕文雪：撰写——审稿与编辑、方法学、数据分析。
马继志：撰写——审稿与编辑、数据分析。
林宇彤：撰写——审稿与编辑、可视化。
吴宇辰：撰写——
