《Phytomedicine Plus》：Preclinical Study of Cannflavins A and B Action Against Glioblastoma Cells
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多形性胶质母细胞瘤（GBM）是一种侵袭性强、预后极差的脑肿瘤，现有疗法有限。为解决此难题，研究人员以大麻植物中提取的Cannflavin A和B为对象，开展了其在体外对GBM细胞的抗肿瘤活性研究。结果表明，Cannflavin B能显著且剂量依赖性地降低A-172和U-87细胞的活力，并在低于致死浓度下有效抑制细胞的迁移和侵袭，显示了其作为新型GBM治疗药物的潜力。这项发表于《Phytomedicine Plus》的研究为探索大麻来源的黄酮类化合物在癌症治疗中的应用开辟了新路径。
多形性胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最具侵袭性和最常见的原发性脑肿瘤。它生长迅速，并像藤蔓一样弥漫性浸润到周围的健康脑组织中，导致手术难以完全切除。尽管采用手术、放疗和替莫唑胺（TMZ）化疗相结合的积极标准治疗方案，患者的预后依然极差，中位生存期仅约15个月。肿瘤细胞的侵袭能力和对TMZ的耐药性，通常在治疗后数月内导致疾病复发。因此，寻找能够有效抑制GBM细胞生长、迁移和侵袭的新型治疗药物，成为一项紧迫且极具挑战性的任务。在此背景下，研究人员将目光投向了自然界中广泛存在的一类植物化学物质——黄酮类化合物。许多黄酮类化合物（如芹菜素、木犀草素等）已显示出在多种癌症中的抗肿瘤潜力。其中，从大麻（Cannabis sativa）中分离出的Cannflavin家族成员因具有强大的抗炎活性而受到关注，但它们在攻击脑癌细胞方面的功效尚不明确。为此，来自圭尔夫大学的研究团队在《Phytomedicine Plus》期刊上发表了这项临床前研究，系统评估了Cannflavin A和B对抗GBM细胞的效果。
研究人员采用了多种in vitro（体外）关键技术来评估这两种化合物的效应。研究使用了两种经典的人GBM细胞系（A-172和U-87）。实验方法涵盖了评估细胞活力的刃天青还原实验和乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性实验，检测细胞周期的流式细胞术，以及评估细胞迁移和侵袭能力的划痕实验、Transwell侵袭实验和肿瘤球体侵袭实验。此外，为了在更接近生理环境的模型中验证药效，研究还创新性地采用了人诱导多能干细胞（iPSC）衍生的脑类器官与表达绿色荧光蛋白（GFP）的U-87肿瘤球体进行共培养，以模拟肿瘤细胞在脑组织中的浸润过程，并观察Cannflavin B的抑制作用。在机制探索方面，研究人员通过蛋白质印迹法（Western Blot）分析了化合物处理后细胞中关键信号通路蛋白（如TrkB、MAPK、AKT）的磷酸化状态。
研究结果
Cannflavin B降低GBM细胞活力
研究团队首先测试了Cannflavin A和B对A-172和U-87细胞活力的影响。结果显示，Cannflavin B在1-20 μM浓度范围内，能显著且剂量依赖性地降低两种细胞系的活力，作用在48小时和72小时更为明显。相比之下，Cannflavin A在相同浓度下对细胞活力没有显著影响。研究还比较了Cannflavin B与其合成前体chrysoeriol以及另一种O-甲基化黄酮techtochrysin的效果，发现Cannflavin B的抗存活效应更强、所需浓度更低，提示其B环上的异戊烯基修饰（prenylation）可能增强了其生物活性。
Cannflavin A和B不诱导GBM细胞坏死或凋亡
为了确认Cannflavin B对细胞活力的影响不是由细胞膜破裂导致的坏死引起，研究人员进行了LDH释放实验。结果表明，在10-20 μM浓度下处理24小时，Cannflavin A和B均未引起明显的LDH释放。此外，使用TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记）检测凋亡的实验也证实，用10 μM Cannflavin A或B处理A-172细胞24小时，并未引起广泛的DNA断裂和凋亡。这说明在较低浓度下，这两种化合物的作用机制并非直接诱导细胞程序性死亡。
Cannflavin A和B不影响A-172和U-87的细胞周期
通过流式细胞术分析细胞周期分布，研究人员发现，在1-5 μM的低浓度范围内处理24小时，Cannflavin A和B均未显著改变A-172或U-87细胞在G1期、S期和G2/M期的分布比例。这表明其早期抗肿瘤效应与干扰细胞周期进程无关。
Cannflavin限制GBM细胞的迁移和侵袭
划痕迁移实验显示，在低于显著影响细胞存活的浓度下（Cannflavin A 10 μM， Cannflavin B 5 μM），两种化合物均能显著延迟A-172细胞向划痕区域的迁移，其中Cannflavin B的效果更为突出。Transwell侵袭实验进一步证实，用10 μM Cannflavin B预处理的A-172细胞，其穿过Matrigel基质的能力被抑制了超过50%。在三维肿瘤球体模型中，将U-87细胞形成的肿瘤球体嵌入Matrigel后，Cannflavin A（10 μM）和Cannflavin B（5 μM）均能显著抑制球体向外周区域的扩展，减少了球体的面积和半径，显示了其强大的抗侵袭能力。
Cannflavin B限制脑类器官上U-87肿瘤球体的生长和浸润
为了在更复杂的体外环境中验证效果，研究人员将表达GFP的U-87肿瘤球体与人iPSC衍生的脑类器官进行共培养。在肿瘤球体附着并生长一段时间后，向培养基中加入5 μM的Cannflavin B。结果显示，与仅用DMSO处理的对照组相比，接受10天Cannflavin B处理的共培养体系中，肿瘤球体的尺寸显著减小。尽管GBM细胞向类器官内部的浸润比例在统计学上未显示显著差异，但Cannflavin B处理组的GFP阳性信号（代表肿瘤细胞）始终较少，这为Cannflavin B在模拟脑组织的复杂环境中仍能限制肿瘤生长提供了支持性证据。
Cannflavin A和B对GBM细胞中TrkB信号的影响
考虑到之前有研究表明TrkB（酪氨酸激酶受体B）抑制剂ANA-12能降低A-172细胞活力，且团队前期工作发现Cannflavin能干扰原代神经元中的TrkB信号，研究人员进一步探究了其分子机制。蛋白质印迹分析表明，在A-172细胞中，Cannflavin A（20 μM）和Cannflavin B（10-20 μM）处理6小时，确实能显著降低TrkB在酪氨酸705位点（Y705）的磷酸化水平，ANA-12也有类似效果。然而，这一变化并未导致下游关键效应因子p44/p42 MAPK和AKT的磷酸化水平发生显著改变。更值得注意的是，在U-87细胞中，无论是Cannflavin还是ANA-12，均未显著影响TrkB Y705的磷酸化。这些结果表明，Cannflavin B在GBM细胞中观察到的抗迁移、抗侵袭等表型效应，很可能与直接干扰TrkB信号通路无关，暗示其通过其他未知的分子靶点发挥作用。
结论与讨论
本研究表明，Cannflavin B，而非Cannflavin A，在体外对多形性胶质母细胞瘤细胞展现出多方面的治疗潜力。其核心发现是：Cannflavin B能以剂量依赖的方式有效降低A-172和U-87细胞的活力；更重要的是，在低于引起显著细胞死亡的浓度下，它能强力抑制GBM细胞的迁移和侵袭能力，这一特性在二维划痕实验、三维Transwell侵袭模型、肿瘤球体外扩模型乃至更为生理相关的脑类器官-肿瘤球共培养系统中都得到了验证。这一系列结果凸显了Cannflavin B作为抗GBM药物的独特优势：它不仅能够杀伤肿瘤细胞，更关键的是能够阻断肿瘤扩散和浸润这一导致治疗失败和患者死亡的核心环节。
然而，机制探索部分带来了一个有趣的转折。尽管Cannflavin B和作为阳性对照的TrkB抑制剂ANA-12都能在A-172细胞中降低TrkB Y705的磷酸化，但它们均未能影响下游的MAPK和AKT信号通路，且在U-87细胞中甚至不改变TrkB的磷酸化状态。这强烈暗示，Cannflavin B的抗GBM效应可能独立于经典的TrkB信号轴。研究人员在讨论中提出了几种可能性：其一，异戊烯基化（prenylation）增强了Cannflavin B的脂溶性，使其更容易与细胞膜或特定靶蛋白结合，从而增强了其生物活性，这解释了为何其效果优于非异戊烯基化的前体分子chrysoeriol。其二，Cannflavin B可能作用于其他与癌症进展密切相关的信号通路，例如核因子κB（NF-κB）通路。NF-κB在GBM的侵袭表型中扮演关键角色，而结构相似的techtochrysin已被报道能通过抑制NF-κB来对抗结肠癌细胞，这为未来研究指明了方向。确定Cannflavin B的确切分子靶点将是下一步研究的重点，例如可以采用蛋白质组溶解度变化分析（PISA）等高通量手段进行无偏见的靶点筛选。
总之，这项研究首次系统地揭示了Cannflavin B在对抗多形性胶质母细胞瘤方面的显著效果，尤其是在抑制肿瘤细胞迁移和侵袭这一临床难点上表现出色。其作用机制似乎有别于已知的TrkB抑制，这为开发全新作用机制的抗脑癌药物提供了宝贵的先导化合物。未来研究需要在动物模型（如异种移植瘤模型）中验证其体内疗效和药代动力学特性，并探索其与现有标准疗法（如替莫唑胺）的协同作用，以期最终推动其向临床治疗应用转化，为改善GBM患者严峻的预后带来新的希望。
