《Phytomedicine》：NINJ1-Mediated Macrophage Ferroptosis Impairs Diabetic Wound Healing Attenuated by Ruan Jian Qing Mai Formula
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姜黄属根部多物种系统鉴定神经保护活性成分，结合高内涵成像与未标记质谱分析，发现不同物种在细胞器调控上的差异。
崔静|杨家军|黄玲玲|沈晨曦|王星|杨华|高文
中国药科大学中药学院天然药物国家重点实验室，南京211198，中国
摘要
背景
姜黄根（CR）来源于多种姜黄属植物，长期以来被用于治疗神经系统疾病。然而，由于其形态上的相似性和化学成分的多样性，疗效评估变得复杂，对其具有神经保护作用的成分的系统研究仍十分有限。
目的
建立一种综合策略，结合高含量生物活性分析和非靶向化学表征方法，系统地识别四种姜黄属植物（温玉金姜黄（C. wenyujin）、长姜黄（C. longa）、广西姜黄（C. kwangsiensis）和红茎姜黄（C. phaeocaulis）中的神经保护化合物。
方法
利用ponatinib诱导的斑马鱼缺血模型评估提取物的疗效。通过制备液相色谱法对提取物进行分离，构建成分库，并使用UHPLC–QTOF MS进行表征。利用高含量成像（HCI）技术捕捉OGD/R损伤的PC12细胞中的多参数表型特征。采用表型特征映射（PFM）方法，将质谱（m/z）特征与亚细胞表型关联起来，生成基于活性的“m/z–表型”指纹图谱。活性得分（AS）和聚类得分（CS）用于量化特征与表型之间的关联，以注释生物活性化合物并推断其作用机制。
结果
姜黄提取物能够减少血栓形成、行为缺陷和炎症，其中红茎姜黄（CLR）的疗效最强。根据计算得出的AS和CS，分别筛选出CWR、CPR、CLR和CKR的582、884、835和730个候选活性m/z特征。最终共鉴定出69种化合物。CWR和CPR中以倍半萜类化合物为主，而CLR的核心成分是姜黄素类化合物。亚细胞分析显示不同物种具有特定的调控偏好：CWR主要影响细胞核形态，CPR和CKR影响线粒体结构，CLR则影响细胞骨架完整性。
结论
这种非靶向代谢组学与高含量筛选相结合的方法能够快速识别四种化学性质不同的姜黄属植物中的神经保护化合物。这种方法为复杂草药系统中生物活性化合物的识别及其功能注释提供了可扩展的框架。
引言
姜黄根（CR）来源于多种姜黄属植物的干燥根，包括温玉金姜黄（C. wenyujin）、长姜黄（C. longa）、广西姜黄（C. kwangsiensis）和红茎姜黄（C. phaeocaulis）。临床上，姜黄根被广泛用于治疗中枢神经系统疾病，如抑郁症、中风和阿尔茨海默病。其药理作用与抗氧化应激、抗炎作用、抑制神经元凋亡以及促进神经再生密切相关。不同姜黄属植物之间的化学成分存在显著差异，长姜黄富含姜黄素类化合物，而其他种类则以倍半萜类化合物为主。然而，不同物种之间的形态相似性给临床鉴定带来了困难，也影响了疗效的一致性。此外，对其差异化的神经保护作用和活性成分的系统研究仍不足。
从化学成分复杂的多源草药中筛选生物活性化合物是一个重大挑战。传统的分离技术（如硅胶柱色谱、大孔树脂色谱和制备HPLC）通常耗时且容易忽略成分间的协同效应。虽然UHPLC–QTOF MS提供的非靶向代谢组学能够进行全面化学分析，但无法直接将化合物与生物活性关联起来。传统的光谱-效应相关性方法有助于识别潜在活性成分，但数据处理、药理模型和验证方面的局限性限制了化学成分与疗效关系的精确解析。
高含量成像技术为研究复杂草药系统提供了有力工具。在单细胞分辨率下量化多参数细胞表型，能够捕捉化合物引起的细微变化，特别适用于多组分、多靶点的研究。自动化成像与多变量分析的结合实现了高通量药理学评估和机制解析。Kurita等人开发了化合物活性映射平台，可通过质谱信号与表型筛查的关联直接预测活性化合物及其作用机制。我们开发了中药功能注释平台（TCMs-CFA），通过整合非靶向化学分析和高含量细胞表型响应，预测草药中的心肌保护化合物及其潜在作用机制。
在本研究中，我们结合高含量表型分析和化学分析，系统地识别并注释了不同来源姜黄根中的神经保护化合物。提取物通过制备液相色谱法分离和分级，构建成分库。每个成分均通过UHPLC–QTOF MS进行化学表征，并在OGD/R损伤的PC12细胞中进行高含量成像分析，以获取多参数表型数据。通过Python数据集成流程，将质谱数据与所有成分的多维表型参数关联，构建了基于m/z值和保留时间的表型特征映射（PFM）。根据计算出的活性得分（AS）和聚类得分（CS），从四种姜黄根中筛选出候选神经保护化合物，每种化合物都表现出独特的细胞器相关特征。进一步通过高含量表型分析验证了14种参考化合物，包括3种姜黄素类和11种倍半萜类化合物。总体而言，这一化学-表型注释框架为解析多源姜黄根的药理基础提供了方法学参考，有助于发现活性化合物并提升复杂草药的质量控制。
化学物质和试剂
无水乙醇购自GENERAL公司。甲酸和异丙醇购自ROE（美国纽瓦克）。乙腈和甲醇购自Merck（德国达姆施塔特）。所有有机试剂和化学品均为分析级。Alexa FluorTM 488 phalloidin（A12379）、ER-TrackerTM Red（BODIPY TR glibenclamide，E34250）和MitoTrackerTM Deep Red（M22426）购自Thermo Fisher Scientific（美国）。DAPI染色试剂盒（BD5010）购自Bioworld。
干燥的姜黄根...
四种姜黄根的神经保护效果评估
神经系统疾病对人类健康构成严重威胁，其中中风是全球导致死亡和残疾的主要原因之一。脑缺血会破坏神经元能量代谢，引发氧化应激和炎症反应，进而导致神经元凋亡和坏死。减轻神经元损伤是中风治疗中的主要挑战。
为了初步验证神经保护效果...
结论
本研究建立了一种综合策略，结合高含量生物活性分析和非靶向化学表征方法，系统地识别四种姜黄根中的神经保护化合物。通过将UHPLC–QTOF MS得到的化学谱与OGD/R损伤的PC12细胞中的多参数亚细胞表型关联，构建的表型特征映射（PFM）实现了候选化合物活性m/z特征的高通量筛选和注释。
数据和材料的获取
本研究生成和/或分析的数据可应要求向通讯作者索取。
作者贡献声明
崔静、杨家军、黄玲玲和沈晨曦负责实验和数据分析。王星参与了质谱数据的鉴定。崔静和高文负责初稿撰写。主要研究者高文和杨华提出了科学思路，监督项目设计并完善了手稿。所有作者共同讨论了研究结果。
未引用的参考文献
Hao等人，2019年；Jaiswal等人，2014年；Li等人，2022a年；Li等人，2020年；Min等人，2019年；Navin Kumar等人，2024年；Sera等人，2014年；Thi等人，2021年；Vijayan和Rekha，2019年；Wei等人，2019年；Xiang等人，2020年；Zhao等人，2016年；Zhou等人，2018年；Guo等人，2023年
CRediT作者贡献声明
崔静：初稿撰写。杨家军：数据整理。黄玲玲：初稿撰写。沈晨曦：数据整理。王星：数据整理、审稿与编辑。杨华：审稿与编辑、资金获取。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（2024YFC3506500）、国家自然科学基金（82274092）以及天然药物国家重点实验室项目（中国药科大学，SKLNMZZ2024JS40）的支持。所有作者感谢中国药科大学天然药物国家重点实验室的李郭和魏江提供的技术支持。
