CaBBX16基因对光照有响应，并能调控辣椒叶片中花青素的生物合成过程

《Plant Science》：CaBBX16 responds to light irradiation and regulates the biosynthesis of anthocyanins in pepper leaves

花青素积累与HY5蛋白、B-box蛋白（CaBBX16）的互作机制研究。通过RNA-seq和VIGS实验发现，光诱导辣椒叶花青素合成中，CaBBX16通过B-box结构域与CaHY5结合，激活CaMYC和CaMYBa表达，促进花青素生物合成相关基因（F3'5'H、DFR、ANS、UFGT）上调。证实CaBBX16是光信号调控花青素积累的关键因子。

　　

陈伟林|卢同耀|梁光波|马晓伟|朱彪

农业农村部亚热带果蔬质量安全控制重点实验室，浙江省蔬菜种质创新与品质育种重点实验室，浙江农林大学园艺科学学院，中国杭州311300

摘要

光照在促进辣椒（Capsicum annuum L.）叶片中花青素的积累方面起着关键作用。ELONGATED HYPOCOTYL 5 (HY5) 蛋白作为光诱导花青素生物合成的关键调节因子；然而，HY5介导的调控机制的精确分子机制尚未完全阐明。在本研究中，我们发现了一种B-box (BBX) 蛋白 CaBBX16，它与花青素合成密切相关，并对光刺激有响应。我们证明了 CaBBX16 通过其保守的 B-box 结构域与 CaHY5 相互作用，从而增强了参与花青素生物合成的关键调节因子（包括 CaMYC 和 CaMYBa）的表达。瞬时过表达和病毒诱导的基因沉默 (VIGS) 实验证实了 CaBBX16 表达与辣椒中花青素合成基因转录之间存在强烈的正相关关系。总体而言，我们的发现揭示了 CaBBX16 与 CaHY5 合作调节辣椒叶片中的花青素合成，为 BBX 蛋白在光介导的花青素积累中的功能作用提供了新的见解。

引言

在自然界中，植物叶片颜色的多样性主要由叶绿素、花青素和类胡萝卜素的相对含量决定。花青素属于黄酮类化合物（Koes 等，2005），它们不仅参与叶片着色，还在植物抵御生物和非生物胁迫中发挥重要作用（Gould，2004）。在辣椒中，花青素主要由飞燕草素组成（Tang 等，2020），其生物合成途径已被充分研究。参与该途径的基因大致分为早期生物合成基因（EBGs）和晚期生物合成基因（LBGs）。EBGs 包括查尔酮合酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）和黄酮 3-羟化酶（F3H），而 LBGs 包括黄酮 3′,5′-羟化酶（F3′5′H）、二氢黄酮醇还原酶（DFR）、花青素合成酶（ANS）和 UDP-半乳糖：黄酮 3-O-半乳糖基转移酶（UFGT）（He 等，2010）。LBGs 的表达对于确定植物中的花青素类型和积累水平尤为重要（Cheng 等，2019；Jaakola，2013）。

黄酮类化合物生物合成的转录调控是一个复杂的过程，涉及许多转录因子。这些因子及其对下游结构基因的调控作用共同决定了花青素合成基因的时空表达模式，最终控制着花青素的积累（Sunil 和 Shetty，2022）。值得注意的是，MBW 复合体——由 R2R3-MYB、基本螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子和 WD40 重复蛋白组成——在激活或抑制下游结构基因以控制花青素合成中起着核心作用（Ramsay 和 Glover，2005）。在辣椒中，CaMYBa-CaMYC 蛋白复合体是 LBG 表达和花青素积累的关键调节因子（Lu 等，2018；Tang 等，2020；Zhang 等，2015），其中 CaMYC 在叶片中的表达是决定花青素水平的关键因素（Lu 等，2018）。多种因素影响 CaMYC 和 CaMYBa 的表达，其中光照是一个重要的调控信号。

植物具有一系列响应光照的基因，能够感知光照环境的变化并传递光信号（Jing 和 Lin，2020；Qi 等，2022）。HY5 直接作用于光受体下游，传递光信号，从而调节植物发育和次生代谢产物的合成。在拟南芥中，AtHY5 直接结合到花青素合成基因（如 AtCHS）和调节基因（如 AtPAP1）的启动子上，激活它们的表达（Shin 等，2013；Lee 等，2007）。在番茄中，SlHY5 通过转录激活与花青素相关的 MYB 基因（如 SlAN1）和结构基因，促进花青素的产生（Liu 等，2018；Qiu 等，2019）。先前的研究表明，CaHY5 通过直接调节 CaF3′5′H 和 CaDFR 来增强辣椒茎中的花青素积累（Chen 等，2022）；然而，CaHY5 在叶片花青素合成中的下游靶标仍不明确。

BBX 家族蛋白是一类锌指蛋白，其 N 端区域包含一个或两个保守的 B-box 动机（Gangappa 和 Botto，2014）。这些蛋白帮助 HY5 在响应外源刺激（特别是光照和寒冷）时执行生物功能（Xu，2020）。在拟南芥中，BBX 基因根据保守结构域被分为五个亚家族（Khanna 等，2009），AtBBX20、AtBBX21 和 AtBBX22 通过与 AtHY5 的相互作用直接调节花青素合成基因（Crocco 等，2010；Wei 等，2016）。关于 BBX 介导的花青素调控的研究在园艺作物中也受到了关注：在红梨中，PpBBX16 与 PpHY5 形成蛋白复合体，上调 PpMYB10 的表达并促进花青素积累（Bai 等，2019）；在杨树中，PtrBBX23 与 PtrHY5 形成复合体，共同激活 PtrMYB115 和 PtrMYB119（Li 等，2021a）；在甜樱桃中，PavBBX6/9 协同激活 PavUFGT 以增强花青素积累（Wang 等，2023）。这些发现表明 BBX-HY5 复合体是植物中花青素合成的保守调控模块。近年来，BBX 基因家族与花青素等色素生物合成之间的关系成为研究热点。例如，在 Vaccinium spp 中发现了 83 个 VcBBX 基因和 24 个 VdBBX 基因，这些基因与光信号传导和果实成熟有关（Xue 等，2025）。此外，在 Lagerstroemia indica 的基因组中鉴定出了 41 个 BBX 基因，其中 LiBBX4 被证明通过 LiHY5 途径直接参与花青素合成（Deng 等，2025）。另外，在 Litchi chinensis 的基因组中也检测到了 LcBBX 基因，有假设认为 LcBBX4 可能直接调节荔枝果皮中的花青素合成（Liu 等，2025）。综上所述，这些发现共同表明 BBX 基因家族与植物的光信号传导和花青素合成密切相关。在辣椒中，研究人员还研究了 CaBBX 基因家族，并探讨了其与花青素合成之间的关联。辣椒基因组编码 23 个 BBX 基因，其中 7 个（CaBBX1、CaBBX9、CaBBX13、CaBBX16、CaBBX20、CaBBX21 和 CaBBX23）被认为参与花青素合成（Wang 等，2022）。然而，CaBBX 蛋白调控花青素合成的分子机制仍不清楚。

紫叶辣椒中的花青素积累与光照强度、光照时间和品质密切相关。通过对不同颜色辣椒叶片进行比较转录组学和代谢组学分析，我们发现 CaBBX16 是一个表达与花青素含量高度相关的基因。我们证明 CaBBX16 与 CaHY5 形成蛋白复合体，促进 CaMYC 和 CaMYBa（花青素生物合成中的关键转录因子）的表达，从而正向调节辣椒叶片中的花青素积累。此外，在紫叶辣椒中，通过 VIGS 抑制 CaBBX16 可降低花青素含量并在光照条件下下调花青素合成基因的表达。总体而言，我们的结果确定 CaBBX16 是辣椒中花青素合成的正向调节因子，并为这种作物的光介导的花青素积累调控网络提供了新的见解。

部分摘要

植物材料和处理

用于表型观察的紫叶辣椒（Capsicum annuum ‘Purple Flash’）在浙江农林大学的农业园温室中种植。在 8–10 叶期，植株接受了黑色遮阳网的遮荫处理。在遮荫后的第 7、14 和 28 天拍摄叶片照片，并从相同的生理位置采集样本。每个处理包括三个生物学重复实验，每个重复实验有五片叶片。样本立即冷冻

CaBBX16 表达与辣椒叶片中的花青素含量呈正相关

为了识别调控辣椒叶片花青素合成的转录因子，我们在之前的研究中对一种紫叶辣椒品种进行了联合 RNA-seq 和代谢组学分析（图 1a）。这种紫叶辣椒品种表现出四种典型的叶片颜色表型，即 RW（白色）、RHW（一半白色一半绿色）、RHP（一半紫色一半绿色）和 RP（紫色）。我们的研究小组通过代谢组学测序先前发现 RW 叶片缺乏花青素，而 RP 叶片

讨论

光照是调节多种植物物种中花青素生物合成的关键环境因素，包括茶（Zhao 等，2023）和苦樱桃（Li 等，2021b）。在本研究中，我们证实光照促进了辣椒叶片中花青素的积累，而遮荫导致色素沉着减少和花青素含量降低（图 1c，d）。光照还诱导了花青素合成基因（CaF3′5′H、CaDFR、CaANS、CaUFGT）、调节基因（CaMYBa、CaMYC

CRediT 作者贡献声明

陈伟林：撰写 – 审稿与编辑、软件使用、资源准备、数据分析。马晓伟：方法学研究。卢同耀：数据可视化、方法学研究。朱彪：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、资金申请。梁光波：方法学研究。

利益冲突声明

我们，即手稿“CaBBX16 对光照反应并调节辣椒叶片中花青素的合成”的作者，特此声明不存在任何利益冲突。

本研究是独立进行的，没有任何可能不恰当地影响或偏倚工作的财务或个人关系。所有作者均无相关的财务利益（如资助、费用、专利所有权等）或非财务利益（如个人关系等）

致谢

我们感谢 浙江省植物育种重大科技项目（2021C02065）对本研究的财政支持。