人类血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1）的过表达使转基因水稻（Oryza sativa L.）对氧氟芬（oxyfluorfen）诱导的光动力胁迫产生过度敏感性

《Plant Science》：Overexpression of human heme oxygenase-1 confers hypersensitivity to oxyfluorfen-induced photodynamic stress in transgenic rice ( Oryza sativa L.)

植物血红素代谢酶HO-1过表达增强水稻对光动力损伤 herbicide oxyfluorfen的敏感性，其机制涉及pro-oxidant效应、porphyrin代谢紊乱及抗氧化酶活性失衡。

　　

李东基|Tran Lien Hong|金素珍|李亨允|金基彬|Jung Sunyo

韩国庆北国立大学生命科学与生物技术学院，BK21 FOUR KNU创意生物研究小组，大邱41566

摘要

植物血红素加氧酶-1（HO-1）是血红素降解所需的关键酶，在多种非生物胁迫下会被诱导表达，通常被认为具有抗氧化应激的保护作用。我们培育了过表达人类HO-1（hHO1-OE）的转基因水稻，以研究其在光动力损伤（由过氧化除草剂氧氟芬OF引起）中的作用。与野生型（WT）植物相比，hHO1-OE品系在OF处理后表现出更严重的叶片坏死。这些转基因品系还显示出更高的电解质泄漏率、丙二醛水平、降低的光合效率以及更高的H?O?积累量，同时光敏剂原卟啉IX（Proto IX）的积累量也高于WT植物。在OF处理30小时后，转基因植物的Mg-Proto IX、叶绿素和血红素含量下降幅度更大，参与卟啉生物合成的大多数基因表达也受到显著下调。此外，hHO1-OE品系的抗坏血酸氧化还原状态更不稳定，依赖血红素的H?O?清除酶的诱导作用较弱。总体而言，这些结果表明，hHO1的过表达通过扰乱卟啉代谢和氧化还原平衡增加了植物对OF诱导的光动力胁迫的敏感性。我们的发现强调了维持适当HO-1水平对于提高抗逆性的重要性。

引言

卟啉代谢在植物生长、光合作用和应激反应中起着核心作用，因为它为叶绿素、血红素和信号中间体提供原料（Beale和Weinstein，1990；Tanaka和Tanaka，2007）。血红素作为许多蛋白质的辅基，参与电子转移、氧代谢、酶促反应和信号传导（Wagener等人，2003；Chi等人，2013；Kim等人，2014）。卟啉代谢途径始于前体5-氨基乙酰丙酸（ALA），经过原卟啉原IX（Protogen IX）的氧化生成原卟啉IX（Proto IX），这一过程由原卟啉原氧化酶（PPO）在共同分支点催化（Beale和Weinstein，1990；Tanaka和Tanaka，2007）。Proto IX随后分为两条途径：Fe螯合酶将Fe2?结合形成血红素，而Mg螯合酶将Mg2?结合形成叶绿素前体Mg-Proto IX（Beale和Weinstein，1990；Li等人，2024）。

血红素加氧酶-1（HO-1）是卟啉代谢途径中血红素分支的关键酶，它催化血红素的降解，生成具有抗氧化作用的胆绿素IXα（BV），同时释放亚铁离子（Fe2?）和一氧化碳（Terry等人，2002；Singh和Bhatla，2022）。在植物和动物中，HO-1参与细胞应激适应过程中的活性氧（ROS）清除（Ryter和Tyrrell，2000；Baranano等人，2002；Balestrasse等人，2005；Balestrasse等人，2006；Cao等人，2023）。在动物体内，HO-1兼具细胞保护性抗氧化功能，在某些条件下还表现出促氧化作用（Ryter和Tyrrell，2000）。植物中的HO-1表达受多种非生物胁迫的诱导，包括UV-B辐射（Yannarelli等人，2006）、金属毒性（Balestrasse等人，2005；Balestrasse等人，2006；Shen等人，2011）和盐胁迫（Cao等人，2011；Xie等人，2011；Zhu等人，2014；Nguyen等人，2023），这表明其在应激适应中的作用。值得注意的是，水稻的HO-1（OsHO-1）与人类HO-1（hHO1）的序列同源性仅为18%，而与拟南芥（61%）、小麦（78%）和玉米HO-1（80%）的同源性要高得多（图S1）。尽管植物HO-1的抗氧化功能已经得到较好研究，但其潜在的促氧化作用尚未得到充分探索。

一种光敏型过氧化除草剂氧氟芬（OF）会抑制PPO活性，导致Proto IX积累，后者从质体扩散到细胞质中，在那里通过质膜结合的PPO样酶非酶促氧化生成光敏性的Proto IX（Lee等人，1993；Lee和Duke，1994）。在光照和分子氧存在下，这种细胞质中的Proto IX积累会引发ROS生成，导致脂质过氧化和细胞死亡（Duke等人，1991；Lee和Duke，1994）。抗氧化防御机制为细胞提供了高效的ROS清除机制（Mittler等人，2004；Sun等人，2025）。抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等酶在H?O?分解和维持细胞氧化还原平衡中起关键作用（Mittler，2017；Huang等人，2019；Dumanovi?等人，2021）。当ROS生成超过这些清除系统的能力时，细胞会进入氧化状态，破坏氧化还原平衡并造成氧化损伤（Huang等人，2019）。

由于某些除草剂（如OF和acifluorfen）会靶向卟啉代谢途径中的关键酶，因此通过遗传手段操纵卟啉代谢已成为提高作物抗除草剂能力的一种有前景的方法（Lee等人，2000；Lermontova和Grimm，2000；Kim等人，2014）。除了抗除草剂能力外，这种途径的工程改造还有效提高了转基因水稻对干旱和缺铁等环境胁迫的耐受性（Phung等人，2011；Tran等人，2023）。这些发现表明，卟啉代谢途径是代谢工程改善作物在各种非生物胁迫下表现的战略目标，包括除草剂暴露。

本研究旨在阐明HO-1过表达如何影响植物对OF诱导的除草剂胁迫的反应，特别关注HO-1的潜在抗氧化或促氧化作用。我们培育了过表达hHO1的转基因水稻，以避免内源性OsHO-1基因的共抑制，并确保hHO1的强烈过表达。我们评估了野生型（WT）和转基因植物的氧化应激水平及细胞氧化还原平衡，并比较了两者之间卟啉代谢中间体及其合成基因的表达谱。这项研究为理解HO-1在植物应激反应中的双重功能提供了新见解，为未来通过工程改造卟啉代谢途径以提高作物对除草剂和其他非生物胁迫的耐受性提供了理论基础。

部分摘要

转化载体的构建及转基因水稻的制备

为了培育过表达hHO1的转基因水稻，使用了全长hHO1编码序列（GenBank登录号X06985），未进行密码子优化以适应植物表达。使用含有Hin dIII位点（正向5′-ACCAAAGCTTATGGAGCGTCCGCAACCC-3′）和Kpn I位点（反向5′-TTTTGGTACCAAACTCACATGGCATAAAGCCC-3′）的引物组通过PCR扩增该编码序列。经Hin dIII和Kpn I消化的PCR片段被插入pBluescript II SK（pBSK，Stratagene，美国加利福尼亚州拉霍亚）质粒中。

过表达hHO1的转基因水稻的构建与鉴定

使用pGA1611:hHO1载体构建了过表达hHO1的转基因水稻（图1A）。通过RT-qPCR和免疫印迹分析验证了hHO1的表达情况。所有五个转基因品系（hHO1-OE-5、11、16、19和21）在mRNA水平上均表现出强烈的hHO1表达，而WT植物中未检测到hHO1表达（图1B）。相应地，hHO1蛋白的分子量约为32.8 kDa，在所有转基因品系中均存在，而在WT植物中不存在（图1C）。

讨论

血红素是许多参与ROS清除、氧化还原平衡和细胞防御的酶的必需辅因子，因此需要进一步研究其在应激适应过程中的代谢调控机制。HO-1催化血红素降解为胆绿素IXα（BV），同时释放亚铁离子（Fe2?）和一氧化碳（Terry等人，2002；Singh和Bhatla，2022）。研究表明，HO-1在多种胁迫下会被诱导表达，包括镉胁迫（Noriega等人，2004；Balestrasse等人，2005）和盐胁迫（Zilli等人，2008；Xie等人，2011；Nguyen等人）。

资助

本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）基础科学研究计划的支持，该计划由教育部资助（NRF-2020R1I1A3073932）。此外，本研究还得到了韩国国家研究基金会（NRF）为硕士/博士生及博士后（LAMP）项目提供的资助（项目编号RS-2023-00301914）。

作者贡献声明

李东基：撰写初稿、研究设计、数据分析、数据管理。Tran Lien Hong：撰写与编辑、方法学设计、数据分析、数据管理。金素珍：研究设计、数据分析。李亨允：撰写与编辑、方法学设计。金基彬：撰写与编辑、方法学设计。Jung Sunyo：撰写与编辑、撰写初稿、验证、监督、概念构建。

利益冲突声明

作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务利益或个人关系：Jung Sunyo表示获得了韩国国家研究基金会的财务支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢Shigeki Shibahara博士和RIKEN生物资源中心提供的人类血红素加氧酶-1（HO-1）cDNA（GenBank登录号X06985）。同时感谢Texas State University的Hong Gu Kang提供pER-mCherry和pBIN61-GFP-HA。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。