综述：红三叶草（Trifolium pratense）中TCP基因家族的全基因组特征分析以及TpTCP18在分枝调控中的功能研究

《Plant Science》：Genome-wide characterization of the TCP gene family in red clover ( Trifolium pratense) and functional analysis of TpTCP18 in branching regulation

红三叶草TCP基因家族包含25个成员，分为PCF、CYC/TB1和CIN亚类。通过表达分析和异源过表达验证，发现CYC/TB1亚群的TpTCP18作为负调控因子，显著抑制拟南芥分枝并激活BRC1相关通路，为牧草遗传改良提供新靶点。

　　

Dandan Su|Wenhua Du

甘肃农业大学草地科学学院，中国兰州730070

摘要

TCP（Teosinte Branched1/Cycloidea/Proliferating Cell Factor）基因家族编码植物特异性的转录因子，在调节植物结构、激素信号传导和应激响应中起着重要作用。虽然已在模式物种中研究了基因，但它们在红三叶草（Trifolium pratense）中的全基因组鉴定及其功能作用仍大部分尚未探索。在本研究中，我们在红三叶草基因组中鉴定出25个基因，并将其分为三个亚家族：PCF、CYC/TB1和CIN。比较基因组分析表明，TpTCP家族的扩展主要是由多倍体水平和特定的重复事件驱动的，而非基因组大小。每个分支内的成员表现出一致的外显子-内含子组织和保守的基序组成。结构分析证实这些蛋白质具有特征性的基本螺旋-I-环-螺旋II结构域。启动子分析显示存在与生长、激素调节和非生物胁迫相关的丰富顺式元件。通过将系统发育分析与转录组分析相结合，我们确定（属于CYC/TB1亚家族）是一个主要候选基因，因为它在腋芽和侧枝中的表达量显著高于在根中的表达量（高达34倍）。亚细胞定位证实TpTCP18是一种核定位蛋白。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中异源过表达显著减少了枝条分枝，延迟了抽薹，并改变了叶片形态。分子特征分析表明通过显著上调侧枝器官中分枝抑制因子AtHB21的转录水平而整合到拟南芥的内源性调控网络中。本研究首次全面分析了红三叶草中的TCP基因家族，并确定是一种保守的腋芽生长负调节因子。这些发现表明通过TCP-HB信号模块调节植物结构，为提高红三叶草的饲料产量和质量提供了有价值的分子靶点。

引言

植物分枝涉及植物生长过程中侧芽或枝条的起始、发育和伸长。它是植物结构的关键决定因素，也是一个重要的农艺性状。分枝在塑造植物形态、优化资源分配和适应环境变化方面起着至关重要的作用。通过提高光合作用效率和增加产量，分枝使植物能够更好地利用土壤养分（Yiotis等人，2021年）。此外，分枝有助于适应环境变化和非生物胁迫，从而提高植物的存活率和适应性。在农业生产实践中，增加枝条数量可以提高某些作物的产量，而减少枝条数量可能会改善植物结构并带来经济效益（Batool等人，2023年）。植物枝条的形成包括两个阶段：腋芽分生组织的建立及其随后的发育或休眠。在有利条件下，休眠的芽可以被重新激活以产生枝条。植物枝条的生长发育受多种因素影响，其中遗传成分在腋芽分生组织的起始中起核心作用。关键调控基因包括LAS（侧芽抑制因子）、RAX1（腋芽分生组织调节因子1）（Jia等人，2020年）、WUS（Wuschel）（Luo等人，2024年）、REV（Revoluta）（Bresson等人，2022年）、LAX2（Lax panicle 2）（Dai等人，2022年）、STM（无茎分生组织）（Lopes等人，2024年）、CUC2/CUC3（Cup-shaped cotyle-don2/3）（Li等人，2020年）、BRC1（Branched 1）（Fichtner等人，2024a年）以及TCP家族成员（Su等人，2024年）。

TCP转录因子是植物特异性的调控因子，参与多种过程，包括叶片形态发生、衰老、开花、侧枝生长和应激响应（Ma等人，2014年；Liu等人，2021年；Camoirano等人，2023年；Zhang等人，2024年；Zhang等人，2024年）。广泛的研究在拟南芥中鉴定出24个基因，在玉米（Zea mays）中鉴定出29个（Chai等人，2017年），在小麦（Triticum aestivum）中鉴定出66个（Zhao等人，2018年），在黄瓜（Cucumis sativus）中鉴定出27个（Wen等人，2020年）。TCP家族分为两个亚家族：I型（PCF亚家族）和II型（CYC/TB1亚家族）。TCP结构域是一种植物特异性的DNA结合模块，与基本螺旋-环-螺旋（bHLH）基序具有结构相似性，但具有独特的序列特征。II型TCP蛋白的特点是具有扩展的基本螺旋-I-环-螺旋-II结构，比I型成员多四个氨基酸（T、A、K、L）。此外，一些II型成员含有富含精氨酸的R结构域，这有助于蛋白质-蛋白质相互作用，并调节多种植物过程，包括腋芽分生组织的发育和分枝（Zhao等人，2020年）。例如，I型TCP因子如AtTCP14和AtTCP15通过拮抗II型因子BRC1的作用来促进拟南芥的腋芽分枝（Gastaldi等人，2024年）。此外，在低磷条件下，通过OsTB1的突变轻微增强分蘖可以改善水稻（Oryza sativa）的籽粒质量和产量（Ishizaki等人，2023年），而CsBRC1特异性调节黄瓜的芽分枝（Shen等人，2021年）。总体而言，TCP转录因子对于调节植物侧枝发育至关重要。

红三叶草（Trifolium pratense L.）是一种高质量的饲料作物，以其高生物量产量、丰富的粗蛋白含量和低纤维含量而著称。其幼枝和叶片是鸡和牛等家畜的宝贵绿色饲料。红三叶草具有显著的特性，包括耐旱性和耐盐性、快速生长以及高效的氮和碳固定能力（Tello-Garcia等人，2023年）。作为关键的饲料作物，红三叶草在全球范围内广泛种植，尤其是在欧亚大陆、北美和其他温带地区。根据最新统计，红三叶草的全球种植面积已达数百万公顷，在多个国家的农业生产中发挥着重要作用。红三叶草的产量与其生长环境、品种选择和管理措施密切相关。在最佳气候条件下，红三叶草的产量可以达到每公顷6-8吨干草（Jing等人，2021年）。高质量的红三叶草不仅为家畜提供丰富的营养，还提高了育种效率。此外，由于其强大的固氮能力，红三叶草还能改善土壤质量并减少对化学肥料的需求，从而带来显著的生态效益（Przybylska等人，2021年）。研究表明，与植物高度相比，枝条数量对红三叶草的干草产量影响更大（Zavyalova等人，2024年）。然而，现有研究主要集中在它的生理特性、农艺特征和栽培方法上（Li等人，2024年；Zhang和Xiao，2024年），对枝条形成的分子机制了解有限。鉴于TCP基因家族在植物发育中的关键作用，本研究采用生物信息学方法鉴定了红三叶草中的TCP家族成员，并分析了它们的基因和蛋白质结构、理化性质、进化关系和保守基序。通过对红三叶草的根、茎、叶、侧枝和腋芽组织的表达分析，我们确定是在分枝组织中高表达的候选基因。为了进一步研究的功能，我们进行了亚细胞定位实验，证实了其核定位，这与它作为转录因子的作用一致。此外，为了评估其在枝条分枝中的调控作用，我们在拟南芥中通过CaMV35S启动子异源表达了。转基因株系经过评估，以观察植物结构和分枝表型的变化。异源表达结果支持作为潜在的腋芽生长负调节因子的作用。

节选

红三叶草中TpTCP基因家族成员的鉴定和染色体定位分析

红三叶草基因组数据（GCA_020283565.1）从NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获取，而拟南芥参考基因组来自拟南芥信息资源（TAIR，https://www.arabidopsis.org/）。拟南芥 TCP蛋白（PF03634）的隐马尔可夫模型（HMM）谱型从Pfam数据库（http://pfam.xfam.org/）获取，使用HMMER3.0在红三叶草全基因组数据集中鉴定基因。BLASTP被用来

红三叶草中基因家族成员的鉴定和染色体定位分析

采用BLASTP和HMMER两种方法对红三叶草基因组数据库中的基因进行了全基因组分析。使用NCBI在线平台上的BLASTP验证了候选蛋白序列的保守性。鉴定结果显示，红三叶草的TpTCP基因家族共有25个成员。TpTCP基因（TpTCP1-TpTCP25）根据其相应蛋白的染色体位置进行命名。TBtools软件用于构建物理图谱

讨论

TCP基因家族编码一类植物特异性的转录因子，参与许多生物过程，如胚胎发育、叶片发育、花器官发育和分枝发育等（Zhang等人，2024年；Zhang等人，2024年；Camoirano等人，2023年；Zhang等人，2024年；Zhang等人，2024年）。随着植物基因组测序技术的进步，已在多种植物物种中鉴定出越来越多的TCP基因家族（Dong等人，2024年；Wang等人，2024a年；Wang等人，2024b年；Panzade等人，2024年）。在本研究中

结论

在本研究中，我们在红三叶草基因组中鉴定出25个基因，并将其分为三个不同的亚家族：PCF、CIN和CYC/TB1。这些基因分布在不同的染色体上，主要编码定位于细胞核的亲水蛋白。系统发育和表达谱分析显示，CYC/TB1亚家族的成员，特别是，在腋芽和侧枝中表现出强烈的组织特异性表达。亚细胞定位证实

CRediT作者贡献声明

Su Dandan：撰写——原始草稿。Wenhua Du：撰写——审阅与编辑。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（32260339）、甘肃省高校产业支持计划项目（2022CYZC-49）、甘肃省重点研发项目（20YF8NA129）、西藏重大项目（XZ202101ZD003N）以及农业生物育种重大项目（2023ZD0402605-02）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们衷心感谢我们研究小组中的所有教师、学生和仪器平台提供的宝贵帮助。