《Process Biochemistry》：Optimization of a green method for extracting lipids from the red yeast
Rhodotorula mucilaginosa: Partial characterization of oil and biomass
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为了应对传统微生物油脂提取方法使用有毒溶剂（如氯仿、甲醇）带来的环境与健康风险，并提升从红酵母中同步回收油脂与类胡萝卜素的效率，研究人员开展了一项关于利用绿色溶剂（如乙酸乙酯）体系优化提取工艺的研究。通过Plackett-Burman和响应曲面法（RSM）优化，建立了基于乙酸乙酯的提取方法，实现了26.0%的脂质回收率，并获得了0.62的绿色度评分。所得微生物油脂富含单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA），类胡萝卜素含量达48.80 μg/g。该研究为开发更可持续、经济的R. mucilaginosa生物精炼平台提供了高效且低毒的提取策略。
在追求可持续发展与绿色化学的今天，微生物，特别是那些能生产高价值代谢物的“细胞工厂”，正成为生物技术领域的明星。其中，一类被称为“红酵母”的微生物，因其能够积累赋予细胞从黄色到红色独特外观的细胞内色素而闻名。这些酵母，如胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa），不仅是非致病性的，还能在多种低成本碳源上茁壮成长，并适应多样的环境条件。更重要的是，它们能同时合成两类宝贵的产物：一类是具有强抗氧化、抗炎和光保护特性的类胡萝卜素，如β-胡萝卜素；另一类则是与植物油成分类似的微生物油脂，其脂肪酸谱富含对心血管健康有益的单不饱和与多不饱和脂肪酸。这类“产油酵母”为食品、饲料、化妆品和制药行业提供了传统农业之外的可持续生产方案。
然而，将这些宝贝从微生物的“保险箱”——细胞壁中高效、安全地取出来，却是一个不小的挑战。传统的提取方法，如经典的Bligh & Dyer法，依赖于氯仿、甲醇等有毒溶剂，不仅对操作人员的健康构成威胁，也带来了环境和废弃物处理的问题。尽管一些新兴的绿色提取技术（如超声波、超临界流体萃取）显示出潜力，但它们往往成本高昂、操作复杂，难以大规模应用。因此，开发一种既高效又环保，同时兼顾经济可行性的提取工艺，对于释放红酵母，特别是能同时产油和产色的R. mucilaginosa的全部生物技术潜力至关重要。这正是本研究旨在攻克的核心问题。
为了回答上述问题，研究人员开展了一项系统的研究。首先，他们利用农业工业副产品（甘蔗糖蜜和玉米浆水）作为培养基，培养R. mucilaginosa CCT 7688菌株以生产富含脂质和类胡萝卜素的生物质。接着，研究核心围绕优化油脂提取工艺展开。他们摒弃了有毒的氯仿/甲醇体系，转而评估以乙酸乙酯、乙醇和乙酸组成的绿色溶剂系统。通过两阶段实验设计：先使用Plackett-Burman设计筛选出对脂质回收率有显著影响的变量（生物质用量、混合溶剂体积、蒸馏水体积和乙酸乙酯体积），再运用中心复合旋转设计（CCRD）对这些关键变量进行优化，以最大化脂质得率。优化后的方法经过实验验证。此外，研究还对提取出的微生物油脂进行了全面的表征，包括脂肪酸谱、理化指标（通过核磁共振氢谱1H NMR测定平均分子量、碘值等）、颜色参数以及类胡萝卜素含量。同时，也对提取油脂前后的完整生物质和残渣生物质的近似组成（脂质、蛋白质、碳水化合物）等进行了分析，并利用扫描电子显微镜（SEM）观察了细胞形态在提取前后的变化。最后，使用AGREE软件对优化方法、初始绿色溶剂法以及传统Bligh & Dyer法的绿色度进行了评估和比较。
本研究主要采用了以下关键技术方法：1. 实验设计与优化：运用Plackett-Burman筛选设计和中心复合旋转设计（CCRD）等统计工具，系统优化以乙酸乙酯为基础的绿色溶剂提取工艺参数。2. 微生物培养与生物质生产：使用农业工业副产品（甘蔗糖蜜和玉米浆水）作为碳氮源，在摇瓶中进行R. mucilaginosa的批次培养，生产目标生物质。3. 分析表征技术：包括气相色谱（GC）分析脂肪酸甲酯以确定脂肪酸谱；核磁共振氢谱（1H NMR）快速测定油脂的碘值、皂化值等理化指标；扫描电子显微镜（SEM）观察细胞形态；以及分光光度法和高效液相色谱（HPLC）测定类胡萝卜素含量和组成。4. 绿色度评估：采用基于绿色分析化学12项原则的AGREE软件，量化比较不同提取方法的可持续性。
3.1. R. mucilaginosa的培养
研究人员在由甘蔗糖蜜和玉米浆水组成的农业工业培养基中成功培养了R. mucilaginosa。培养动力学监测显示，经过144小时，生物质浓度达到12.18 g/L，脂质含量为26.3%（相当于3.21 g/L），类胡萝卜素产量为847.62 μg/L（71.64 μg/g）。这些结果表明，该菌株能够有效利用廉价底物同步积累脂质和色素。
3.2. 实验设计
通过Plackett-Burman设计，确定了生物质用量（X1）、混合溶剂体积（X2）、蒸馏水体积（X3）和乙酸乙酯体积（X5）是对脂质回收率有显著影响的变量。随后的CCRD优化建立了预测模型，并通过响应面等高线图确定了最优参数范围：生物质0.1-0.2 g，混合溶剂4-6 mL，乙酸乙酯2-3 mL。在验证实验（0.1 g生物质，5 mL混合溶剂，0.5 mL水，2 mL乙酸乙酯）中，脂质得率达到26.0 ± 1.7%，与模型预测值（27.3%）接近，证明了模型的可靠性。
3.2.3. 扫描电子显微镜（SEM）
SEM图像清晰展示了提取过程对细胞结构的影响。完整生物质细胞形态完好、表面光滑；经刀式研磨预处理的细胞出现部分变形和破裂；而提取后的残渣生物质则显示细胞严重变形且出现空泡，表明细胞内含物（主要是脂质）已被有效移除，印证了提取过程成功破坏了细胞壁。
3.3. 绿色度评估
使用AGREE软件进行的绿色度评估显示，优化后的方法获得了0.62的总体评分，显著高于传统Bligh & Dyer法。特别是在“使用可再生来源试剂”、“避免使用有毒试剂”和“操作者安全”等原则上得分大幅提升。这表明优化方法在保持提取效率的同时，大大降低了过程的环境影响和健康风险。
3.4. 微生物油脂的表征
3.4.1. 脂肪酸谱
无论采用哪种提取方法（Bligh & Dyer或优化法），所得油脂的脂肪酸组成高度一致，均以不饱和脂肪酸为主（约75%），其中油酸（C18:1）含量最高（51.8%-53.6%），其次是棕榈酸（C16:0）和亚油酸（C18:2）。这表明绿色溶剂提取并未改变油脂的内在品质，其脂肪酸谱与橄榄油相似，具有很高的营养和应用价值。
3.4.2. 颜色评价
对优化法提取的油脂进行为期9天的颜色稳定性监测发现，红色度（a）和黄色度（b）参数均显著下降，总色差（ΔE*ab）达到14.2，表明储存期间类胡萝卜素发生了氧化降解，油脂颜色变浅。这提示该油脂需要合适的保存条件以维持其色泽和可能的生物活性。
3.4.3. 核磁共振（NMR）
通过1H NMR分析，计算出油脂中甘油三酯（TAG）的平均分子量为902.55 g/mol，碘值为74.00 g I2/100 g，皂化值为185.60 mg KOH/g。这些数值进一步证实了油脂主要由长链不饱和脂肪酸构成。
3.10. 完整与残渣生物质的表征
近似组成分析显示，完整生物质含有26.3%脂质、16.0%蛋白质和55.8%碳水化合物。提取油脂后的残渣生物质，其组成转变为67.8%碳水化合物和10.3%蛋白质，脂质含量极低。这表明残渣富含碳水化合物和蛋白质，具有作为动物饲料或进一步转化（如生产生物乙醇）的潜力，体现了生物精炼中“物尽其用”的理念。
本研究成功优化并验证了一种从胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）中提取富含类胡萝卜素微生物油脂的绿色工艺。该工艺以乙酸乙酯、乙醇和乙酸组成的溶剂体系为基础，通过实验设计优化，实现了26.0%的脂质回收率，且绿色度评分（0.62）显著高于传统有毒溶剂方法。所得的微生物油脂品质优良，脂肪酸谱以油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸为主（约占75%），并含有48.80 μg/g的类胡萝卜素。扫描电镜结果证实了提取过程有效破坏了细胞壁。油脂的颜色评估提示其需要避光等稳定化保存。此外，提取后的残渣生物质富含碳水化合物和蛋白质，为整体生物质的高值化利用提供了可能。
这项研究的重要意义在于，它展示了一条结合效率、可持续性与经济可行性的技术路径。首先，它用低毒性、可生物降解的绿色溶剂替代了有害的传统溶剂，显著提升了生产过程的环境友好度和操作安全性，符合绿色化学原则。其次，优化的工艺参数（如减少生物质用量、优化溶剂比例）在保证提取效率的同时，有望降低溶剂消耗和能耗。最重要的是，该研究验证了R. mucilaginosa作为一种“双功能”微生物细胞工厂的潜力，能够利用农业废弃物同步生产高价值的油脂和色素。提取后残渣的再利用构想，进一步支持了建立循环、零废弃的微生物生物精炼平台。因此，这项工作不仅为从红酵母中高效回收活性成分提供了具体的技术方案，也为开发更可持续、综合经济效益更好的微生物制造过程贡献了重要见解，对推动功能性食品、化妆品和可再生能源等领域的绿色发展具有积极影响。
