《Sensors and Actuators B: Chemical》：A CRISPR/Cas12a–Personal Glucose Meter Biosensor for Rapid and Quantitative Detection of
Burkholderia pseudomallei DNA
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CRISPR/Cas12a结合便携式血糖仪实现布氏杆菌病DNA快速定量检测，无需扩增步骤，检测限达0.1 pM，特异性强且与PCR结果高度吻合，适用于资源有限地区。
Nini Luo|Yuping Ruan|Jian Luo|Shen Tian|Dai Kuang|Nan Zhang|Xiaoxia Xie|Zhangmeng Liu|Xiaobing Wang|Juan Yao|Huangxian Ju|Qianfeng Xia
中国海南省海口市海南医学院生命科学与医学技术学院热带疾病控制国家重点实验室，571199
摘要
类鼻疽由Burkholderia pseudomallei (B. pseudomallei)引起，是一种致命的热带传染病，其诊断受到缺乏快速且易于使用的检测方法的阻碍。本文介绍了一种基于CRISPR/Cas12a的生物传感平台，该平台与个人血糖仪（PGM）集成，可实现B. pseudomallei DNA的快速、定量检测，且无需扩增。在该系统中，目标DNA激活Cas12a的切割活性，释放出来自 invertase-Linker-biotin探针的invertase。随后通过磁分离去除未切割的复合物，溶液中剩余的invertase催化蔗糖转化为葡萄糖，由PGM进行定量测量。整个检测过程在50分钟内完成，检测限为0.1 pM，线性动态范围为1 pM至10 nM。该生物传感器对单碱基和多碱基错配序列具有优异的特异性，精度高（CV < 10%），并与临床样本中的qPCR结果高度相关（回收率：98% - 113%）。试剂在储存四周内保持稳定（CV = 4.4%），证明了系统的可靠性。这种无需扩增的平台不依赖于专用实验室设备，为分子诊断技术的发展迈出了重要一步，展示了其作为快速、低成本、用户友好的早期类鼻疽检测工具的潜力，也可能适用于其他传染病的检测。从传感器工程的角度来看，CRISPR/Cas12a–PGM架构是一个可泛化的化学/生物传感平台，只需更换crRNA即可轻松重新编程以针对不同的核酸目标。
引言
类鼻疽是由Burkholderia pseudomallei (B. pseudomallei)引起的一种严重传染病[1]，及时诊断仍然是临床上的一个主要挑战。目前的诊断方法大多不适用于快速决策和即时检测。虽然细菌培养[2]被视为临床金标准，但通常需要几天时间和设备齐全的实验室。免疫学检测[3]可以提供更快的结果，但往往灵敏度不足且存在交叉反应，尤其是在感染早期。分子方法，包括PCR[4]、等温扩增技术[5]和光学传感器[6][7]，虽然分析性能有所提高，但依赖于专用设备、受控的反应条件以及熟练的操作人员。这些要求严重限制了它们在分散或资源有限环境中的应用，而类鼻疽在这些地方最为普遍。因此，迫切需要一种结合分子水平特异性、操作简便性以及即时检测能力的诊断方法。
为了解决这些问题，基于CRISPR的核酸检测技术已成为即时诊断的有希望的方法[8]。在各种CRISPR效应器中，Cas12a在激活后既能特异性切割目标DNA，又能非特异性切割单链DNA报告分子，从而实现超灵敏和高特异性的核酸检测[9]。这一独特的酶学特性推动了众多基于CRISPR的生物传感器的开发，显著提高了检测速度、可编程性和简便性。然而，大多数报道的CRISPR/Cas12a系统依赖于荧光或电化学信号读取，这仍然需要专用设备，限制了它们在即时检测（POC）或现场应用中的适用性[10][11]。此外，由于B. pseudomallei的复杂性和遗传多样性，检测平台必须具备极高的特异性，以避免因序列变异导致的错误结果[12]。
结合高分析精度、便携性和经济性的即时检测（POCT）平台对于传染病监测日益重要[13]。个人血糖仪（PGM）作为全球最普及的诊断设备之一，为此类应用提供了良好的基础。PGM最初用于监测血糖，具有定量电化学检测能力、低成本、广泛的可获取性和出色的操作稳定性。通过将分子识别元件与酶信号转导结合，PGM可以重新用于量化除葡萄糖以外的多种生物标志物——这一策略已在多项最近的生物传感创新中得到成功验证[14]。
基于这些进展，我们开发了一种新型CRISPR/Cas12a-PGM生物传感平台，用于快速、定量且无需扩增地检测B. pseudomallei DNA。在该系统中，目标识别后Cas12a的特异性激活会触发invertase的释放，后者催化蔗糖水解为葡萄糖，随后由商用PGM进行定量。这种方法将复杂的核酸识别转化为简单的定量生化输出，将分子诊断技术与消费级技术相结合。该系统旨在提供一种可靠、低成本且易于部署的类鼻疽诊断方案，特别适用于资源有限或现场环境，这些地方需要快速决策。
试剂和设备
Tris-HCl、二乙基焦碳酸酯（DEPC）水和表1中列出的所有寡核苷酸均购自Sangon BioEngineering（中国上海）。4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（sulfo-SMCC）和invertase购自Sigma-Aldrich（中国上海），蔗糖则来自Dibo Biological（中国上海）。Cas12a酶、crRNA和寡核苷酸按指定方法制备。invertase和Linker通过异双功能接头连接。
工作原理
如图1所示，检测机制遵循明确的技术流程，使用CRISPR/Cas-PGM系统检测B. pseudomallei的目标基因。首先设计一种特定的引导crRNA，该crRNA能够识别B. pseudomallei基因组DNA中的ORF2片段。当目标基因存在时，crRNA通过互补碱基配对与其结合，形成包含Cas12a和DNA的三元复合物，从而激活Cas12a的切割活性。
讨论
本研究提出了一种无需扩增的CRISPR/Cas12a–PGM生物传感策略，用于定量检测B. pseudomallei DNA。通过将目标激活的Cas12a切割活性与invertase-DNA-磁珠报告系统及商用个人血糖仪（PGM）的读取相结合，该系统在50分钟内可实现0.1 pM的检测限，线性范围为1 pM至10 nM，且仅使用广泛可用的仪器设备。这些分析指标表明
结论
总之，我们开发了一种CRISPR/Cas12a-PGM生物传感平台，能够快速、准确且经济高效地检测B. pseudomallei DNA。该检测过程无需复杂设备，可在一小时内完成，并且在临床验证中与金标准qPCR结果高度一致。其便携性、稳定性和简便性表明其在医院和现场环境中的巨大潜力。
作者贡献声明
Xiaoxia Xie：方法学。Nan Zhang：数据管理。Zhangmeng Liu：方法学、数据管理。Jian Luo：方法学、数据管理。Yuping Ruan：撰写——初稿、方法学、研究、数据管理。Dai Kuang：方法学。Shen Tian：方法学。Juan Yao：方法学、研究。Xiaobing Wang：方法学。Qianfeng Xia：撰写——审稿与编辑、方法学、资金申请。Nini Luo：撰写——初稿、方法学。Huangxian Ju：方法学、研究。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号82370018）、中国国家自然科学基金区域创新与发展联合基金项目（U24A20747）以及中国国家重点研发计划（2022YFC2305000, 2022YFC2305003）的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
Nini Luo目前在中国海南医学院生命科学与医学技术学院工作，主要研究方向是细胞内细菌的诊断标志物筛选及检测方法开发。
