《Sensors and Actuators B: Chemical》：Synergistic amplification via CHA–HCR for electrochemical and colourimetric dual-mode detection of carotid atherosclerosis biomarker
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长链非编码RNA SOX2-OT 具有临床应用潜力，但其检测受限于灵敏度不足。本研究通过催化发夹组装（CHA）与杂交链反应（HCR）的串联信号放大策略，构建了电化学/颜色双模式生物传感器，实现10 aM超低检测限，并成功检测血清中SOX2-OT，为颈动脉粥样硬化早期诊断提供新方法。
陈佳怡|袁国林|尚慧|李向东|郭小鹏|胡亚楠|朱德文|谢飞|谢龙川|唐一军|彭春燕
中国湖北省十堰市湖北医药大学太和医院临床分子诊断中心，442000
摘要
长链非编码RNA SOX2-OT（lncRNA SOX2-OT）作为颈动脉粥样硬化的潜在生物标志物，在临床应用中显示出显著潜力。然而，基于lncRNA的颈动脉粥样硬化诊断受到缺乏超灵敏、简单且高度特异的检测方法的限制。为了解决这些挑战，我们引入了一种创新策略，将催化发夹组装（CHA）和杂交链反应（HCR）整合到级联信号放大策略中，以检测lncRNA SOX2-OT并实现精确的颈动脉粥样硬化诊断。CHA能够实现特异性目标识别和初始信号放大，而随后的级联HCR会产生含有多个G四链的结构。同时，亚甲蓝与DNA结构相互作用，产生强烈的电化学信号。此外，模拟过氧化酶的血红素/G四链结构可以催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的氧化，从而实现对目标的可视化检测。该生物传感器的检测限低至10 aM，并成功地在血清样本中检测到了lncRNA SOX2-OT。这种无酶、无标记且高度敏感的CHA–HCR生物传感器在临床应用中具有巨大潜力，尤其是在评估颈动脉粥样硬化的严重程度方面。
引言
动脉粥样硬化性心血管疾病及其临床并发症（包括缺血性中风和心肌梗死）是全球人类发病率和死亡率的主要原因[1]。颈动脉粥样硬化是动脉粥样硬化的主要表现形式；它可能导致短暂性脑缺血发作、中风或脑梗死，如果发展到严重的颈动脉狭窄或阻塞，则会危及生命[2]。早期诊断和及时治疗对于有效预防心血管事件和提高颈动脉粥样硬化患者的生存率至关重要。
尽管当前的成像方法（如颈动脉超声）在评估颈动脉粥样硬化方面具有较高的诊断性能，但这些方法主要提供形态学信息，可能不足以检测早期的分子变化和斑块脆弱性[3]。因此，迫切需要建立一种液体活检方法来促进颈动脉粥样硬化的早期诊断，这对于改善长期临床预后至关重要。长链非编码RNA SOX2-OT（lncRNA SOX2-OT）是一类长链非编码RNA。许多研究表明，lncRNA SOX2-OT在颈动脉粥样硬化患者中的表达增加，并与颈动脉内膜-中层厚度相关。因此，lncRNA SOX2-OT是颈动脉粥样硬化的早期和重要指标，也是一个独立的预后生物标志物[4]；然而，在动脉粥样硬化的早期阶段，其含量相对较低。因此，需要开发一种超灵敏的检测方法来提高早期颈动脉粥样硬化的检测能力，从而降低死亡率。目前，lncRNA主要通过Northern印迹、微阵列和定量逆转录PCR（qRT-PCR）进行检测[5]。然而，这些方法通常受到灵敏度不足、探针设计复杂、操作繁琐、样本消耗量大、仪器要求高以及数据分析复杂等因素的制约。为了提高灵敏度，已经在lncRNA检测中引入了不同的信号放大策略，包括重组酶聚合酶放大、指数放大反应[6]、滚环放大[7]、[8]和环介导等温放大[9]、[10]，但这限制了它们的实际应用[11]。无酶信号放大技术特别适用于开发生物传感检测方法。两种最突出的无酶等温放大技术——杂交链反应（HCR）[12]、[13]、[14]和催化发夹组装（CHA）[15]、[16]、[17]，具有操作简单、成本效益高和灵活性强的优点[18]。然而，它们的信号放大能力有限，无法有效检测低丰度的生物标志物（如lncRNA SOX2-OT）。为了解决这个问题，已经开发了级联放大策略来增强目标信号的放大，从而实现疾病标志物的敏感检测[19]。
除了经济、有效和简便之外，电化学方法对分子水平分析物的检测具有高度敏感性[20]、[21]。然而，在异质性检测中，级联放大的整体效率常常受到界面杂交和捕获步骤的限制。固定在固体基底上的线性单链DNA（ssDNA）探针可能会随机排列，导致局部拥挤，降低目标的可接近性并减慢杂交速度。四面体DNA纳米结构（TDN）提供了一个刚性的三维支架，可以空间编程表面探针的方向和间距，从而改善界面识别和杂交动力学[22]、[23]、[24]。相比之下，比色法能够实现分析物的可视化检测，且不需要复杂的设备；因此，它们适合现场检测[25]、[26]。此外，它们可以与其他方法结合使用，通过基于比色和电化学分析的双模分析相互验证来提高测量精度[27]、[28]。因此，结合电化学和比色方法的双模检测方法是核酸现场分析的强大工具[29]、[30]、[31]、[32]。为了制造这样的生物传感器，开发能够同时产生比色和电化学信号的探针至关重要。基于G四链的DNA酶可以在过氧化氢的作用下催化氧化反应，这是DNA酶领域的一个重要进展[33]、[34]、[35]、[36]。无标记检测方法受到了广泛关注，因为它们可以提供快速且成本效益高的检测方法。在这些检测方法中，血红素的存在会导致G四链/血红素复合物的形成，从而催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺二氢氯化物（TMB）的H2O2介导的氧化，引起明显的颜色变化。
在这项研究中，我们开发了一种无酶和无标记的电化学/比色双模生物传感器，用于检测lncRNA SOX2-OT，该蛋白已被报道为颈动脉粥样硬化的诊断相关和预后不良的生物标志物。为了满足对低丰度lncRNA SOX2-OT进行敏感检测的分析需求，我们采用了无酶等温级联放大策略（CHA–HCR），实现了显著的信号增强和超低的检测限。在这种双模设计中，电化学路径实现了超灵敏的定量分析，而比色路径则基于可观察的颜色变化提供了快速的视觉读数。这种策略能够实现lncRNA SOX2-OT
材料与设备
所有试剂、DNA序列、设备以及一些制备和测量程序在补充信息中有详细描述。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native PAGE）
首先，使用30%丙烯酰胺和5× TBE缓冲液（含有10%过硫酸铵和0.08% N,N,N',N'-四甲基乙二胺）制备了10% Native聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native PAGE）。凝胶制备完成后，将10 μL样品与2 μL 6×加载缓冲液混合均匀后插入凝胶孔中。随后，在1× TBE缓冲液中运行凝胶。
所提出传感系统的原理
在这里，我们构建了一种双模超灵敏电化学/比色生物传感器，使用等温自主核酸放大方法CHA–HCR系统（基于金纳米颗粒[AuNPs]@Ti3C2Tx MXene），用于高性能生物传感器应用。CHA–HCR系统的工作原理及相应生物传感器的构建过程如图1所示。
首先，通过热退火从四种单链DNA自组装TDN，并将其固定在电极上
结论
我们开发了一种无酶电化学/比色双模生物传感器，用于检测lncRNA SOX2-OT，该蛋白已被报道为颈动脉粥样硬化的诊断相关和预后不良的生物标志物。CHA–HCR级联放大提供了强烈的信号放大，使得lncRNA SOX2-OT
CRediT作者贡献声明
谢龙川：研究工作。谢飞：研究工作。彭春燕：监督、资金获取。唐一军：资源提供、资金获取。郭小鹏：验证、研究工作。李向东：方法学设计、数据分析。朱德文：数据分析。胡亚楠：验证、数据分析。陈佳怡：撰写初稿、数据管理。尚慧：撰写初稿、验证。袁国林：撰写、审稿与编辑、数据分析。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了湖北省自然科学基金和中国十堰市（项目编号2024AFD092）、湖北省卫生健康委员会科研项目（WJ2025M138）以及湖北医药大学启动资金计划（2022QDJZR008）的支持。
陈佳怡：拥有硕士学位，隶属于湖北医药大学太和医院临床分子诊断中心。她专注于电化学生物传感器的开发与应用，具有医学实验室科学的学术背景。她的研究方向是设计新型传感界面以检测疾病相关生物标志物。在本研究中，她负责实验的实施、实验数据的收集与分析。
