一种由DNA逻辑门控制的ECL生物传感器，用于检测多重耐药结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）释放的循环游离DNA（cfDNA）

《Sensors and Actuators B: Chemical》：A DNA logic gate-regulated ECL biosensor for detecting cfDNA from multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis

耐药结核分枝杆菌cfDNA检测中基于DNA逻辑门调控的ECL-RET传感器研究，成功实现尿液中rpoB531和katG315突变特异性检测，检测限低至0.9 fM，为非侵入式耐药结核病诊断提供新策略。

　　

孙世华|李文彦|钟伟尧|季芳燕|王佩琳|史京伟|马强

吉林大学中日联合医院实验室医学中心，中国长春，130033

摘要

多重耐药结核病（MDR-TB）是由至少同时对利福平（RIF）和异烟肼（INH）具有抗性的结核分枝杆菌菌株引起的结核病形式。导致RIF和INH抗性的最常见突变分别是rpoB531和katG315。本研究创新性地开发了一种基于DNA逻辑门调控的电化学发光-共振能量转移（ECL-RET）传感器，用于特异性识别来自耐药结核分枝杆菌的游离DNA（cfDNA）。具有优异阳极ECL性能的Zn金属有机框架（Zn-MOF）被用作ECL发射体和能量供体。同时，合成了Au NPs-MXene异质结作为ECL-RET受体。在这种DNA逻辑门调控的传感系统中，含有rpoB531和katG315突变的两个cfDNA链作为AND逻辑门的输入，进一步激活toehold介导的链位移（TMSD）以释放连接链。结果，在Zn-MOF和Au NPs-MXene异质结之间实现了ECL-RET。该DNA逻辑门调控的ECL传感器成功用于检测尿液样本中的rpoB531和katG315突变cfDNA。对rpoB531和katG315的检测灵敏度范围为10 fM至100 nM，检测限（LOD）为0.9 fM。这种策略为MDR-TB的非侵入性和快速诊断提供了一种新方法。

引言

结核分枝杆菌是一种革兰氏阳性需氧细菌，是全球结核病的致病菌[1]。利福平（RIF）和异烟肼（INH）是治疗结核病最有效的两种一线药物[2]。由至少对RIF和INH都具有抗性的结核分枝杆菌菌株引起的结核病被称为多重耐药结核病（MDR-TB），这是由于耐药结核病患者的治疗失败和传播造成的[3]，[4]。2023年，全球约有40万例MDR/RIF耐药结核病病例[5]。高治疗难度和高传染性进一步加剧了MDR-TB的流行。迄今为止，检测MDR-TB的主要方法包括药物敏感性测试和Xpert 结核分枝杆菌/RIF测试[6]，[7]。但漫长的测试时间、收集呼吸道样本的困难以及较高的感染风险无法满足快速临床诊断的需求。目前，cfDNA测试主要应用于肿瘤学和产前诊断领域[8]，[9]。cfDNA（也称为游离DNA）是指存在于人体血液、脑脊液和尿液等体液中的游离DNA片段，不与细胞结合[10]。细菌将cfDNA释放到血液中，其中一部分可以通过肾脏并随尿液排出[11]，[12]。因此，cfDNA作为结核病诊断和治疗监测的非侵入性工具具有巨大潜力。例如，Oreskovic等人使用下一代测序技术研究了结核病患者尿液中cfDNA的大小和组成[11]。Wu等人在支气管肺泡灌洗液中也检测到了cfDNA[13]。然而，目前的cfDNA检测技术仍处于起步阶段，在检测灵敏度方面仍存在挑战。因此，迫切需要开发快速且非侵入性的MDR-TB诊断方法。

电化学发光（ECL）由于其高灵敏度和理想的可控性而成为一种强大的分析技术[14]，[15]。近年来，ECL共振能量转移（ECL-RET）策略受到了广泛关注。例如，Zhong等人报告使用Eu掺杂的MoS₂量子点作为ECL供体，NiMn层双氢氧化物纳米花作为ECL受体来检测miRNA-150-5p，实现了低至1.5 fM的检测限[16]。DNA逻辑门具有出色的可编程性、分子识别特异性和基于互补碱基配对原理的逻辑计算能力。通过DNA逻辑门调控的传感器分析多种生物标志物（如miRNA、ctDNA）可以提高疾病诊断的准确性和可靠性。例如，Jia等人开发了一种基于DNA逻辑门的生物传感器，可以同时检测和量化miRNA-21和miRNA-141[17]。因此，将ECL-RET技术的高灵敏度与DNA逻辑门的可编程逻辑控制能力相结合，可以有效解决复杂样本中多种生物标志物的检测问题。

本研究基于AND逻辑门和ECL-RET机制开发了一种MDR-TB检测策略，实现了对两种耐药cfDNA（rpoB531和katG315）的特异性识别，这两种突变分别是导致RIF和INH抗性的关键突变[18]。如图1a所示，耐药cfDNA通过血液从肾脏进入尿液[12]。rpoB531和katG315被用作AND门的输入（图1b）。然后，设计了一个S/T双链作为逻辑门单元来执行AND布尔逻辑运算。因此，只有当同时存在rpoB531和katG315时，才会发生toehold介导的链位移（TMSD）并释放T链。ECL-RET传感机制如图1c所示。使用Zn(NO?)?·6H?O和9,10-di(p-carboxyphenyl) anthracene（DPA）合成了具有良好阳极ECL性能的Zn金属有机框架（Zn-MOF）。Zn-MOF作为ECL发射体和能量供体，Au NPs-MXene异质结作为ECL-RET受体以实现高效的发光淬灭效应。当T链通过Q1和Q2链将Zn-MOF与Au NPs-MXene异质结连接时，触发ECL-RET过程。结果，Zn-MOF的ECL信号被Au NPs-MXene异质结淬灭，从而实现了尿液样本中rpoB531和katG315的高选择性识别。

实验部分

化学试剂、表征仪器以及所用DNA核苷酸序列的详细信息（表S1）见支持信息。

Zn-MOF的表征

通过SEM图像对Zn-MOF进行了表征。如图1a所示，Zn-MOF具有直径在100至200 nm范围内的立方结构。图1b中，根据Zn-MOF的傅里叶变换红外光谱（FT-IR），2500-3200 cm?1处的羧酸二聚体宽峰消失，表明羧基与Zn2?发生了配位[20]。图1c显示，X射线衍射（XRD）揭示了Zn-MOF的晶体结构

结论

总之，本研究成功开发了一种基于ECL-RET和DNA逻辑门的生物传感器。该传感器能够直接在尿液样本中敏感且特异性地检测携带rpoB531和katG315突变的cfDNA。通过结合ECL-RET的高灵敏度和DNA逻辑门的精确可编程性，该系统实现了对目标cfDNA分子的协同识别。在同时存在katG315和rpoB531的情况下，AND门实现了高效且快速的检测

CRediT作者贡献声明

李文彦：资源管理、项目策划、概念构思。孙世华：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、监督、软件开发、资源管理、方法论、研究实施、资金获取、数据分析、概念构思。王佩琳：软件开发。季芳燕：可视化、监督。钟伟尧：可视化、监督、软件开发。马强：初稿撰写。史京伟：初稿撰写

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（编号32271511）和吉林省发展和改革委员会（编号2024C011-2）的支持。

孙世华是吉林大学的研究生。