一种高灵敏度的近红外-II（NIR-II）比率光声探针，可被一氧化氮快速激活，用于精确地实现对肝脏损伤的体内成像

《Sensors and Actuators B: Chemical》：A highly sensitive NIR-II ratiometric photoacoustic probe activated rapidly by nitric oxide for accurate in vivo imaging of liver injury

NO动态可视化；阴离子策略；NIR-II比率光声探针；肝损伤；信噪比提升

　　

作者名单：毕一东（Yidong Bin）、何宗义（Zongyi He）、黄立贤（Lixian Huang）、李彩英（Caiying Li）、叶芳桂（Fanggui Ye）、赵树林（Shulin Zhao）、黄勇（Yong Huang）、张亮亮（Liangliang Zhang）

单位：中国广西师范大学化学与药学学院药用资源化学与分子工程国家重点实验室、药用资源化学与分子工程重点实验室（教育部资助）、广西民族医药协同创新中心，桂林541004

摘要

一氧化氮（NO）在疾病病理生理过程中扮演着信号分子和炎症介质的关键角色。实时、精确地可视化深层组织中的NO动态对于理解疾病机制和评估药物疗效至关重要。然而，现有的NO探针，尤其是在第一个近红外（NIR-I）波段或单波长“开启”型探针中，存在诸如穿透深度浅、组织散射、响应慢和灵敏度低等局限性。为了解决这些问题，我们采用电子云密度增强策略，通过将阳离子七甲胺花青素骨架替换为阴离子骨架，开发了一种NO激活型第二近红外（NIR-II）波段比率光声（PA）探针（TCF-BA）。这种阴离子修饰策略显著提高了电子云密度，从而增强了其对NO的响应性和灵敏度。TCF-BA探针在NO激活时表现出明显的比率光声响应，实现了高对比度的深层组织成像。利用PA成像的高时空分辨率，我们利用该探针在小鼠肝损伤模型中定量监测了NO的波动。总体而言，本研究提供了一种可靠的分子成像工具，用于研究与NO相关的病理过程，并为设计可激活的NIR-II比率探针提供了有前景的策略。

引言

一氧化氮（NO）是一种关键的气态信号分子，在炎症反应等生物过程中具有强大的介导作用，对多种病理生理途径具有双重影响[1]、[2]、[3]。在典型的生理条件下，它参与调节肝脏灌注、免疫反应和细胞内信号传导[4]、[5]、[6]。与其他重要生物分子类似，NO也具有双重作用：在适当浓度下，它支持生理稳态；而过量产生则会带来不利后果[7]。因此，精确监测内源性NO水平至关重要。然而，由于其仅几秒的极短半衰期，直接检测和定量存在很大挑战[8]。因此，迫切需要建立能够准确映射和分析深层组织环境中NO信号作用的方法。

多种成像技术已被用于NO的体内可视化。电子顺磁共振（EPR）和磁共振成像（MRI）支持深层组织成像，但灵敏度和空间分辨率不足[9]、[10]、[11]、[12]。虽然荧光成像灵敏度很高，但其穿透深度有限（约1毫米），限制了其在深层结构中的应用[13]。在更深层次的解剖结构中获得高保真度的荧光图像仍然是一个未解决的挑战[14]、[15]、[16]。

光声（PA）成像是一种先进的无创成像技术，它结合了近红外（NIR）光激发和超声波接收，具有高分辨率和深层组织穿透能力（可达10厘米）[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]。利用这些特性，已经开发出多种用于生物医学研究和诊断应用的小分子PA探针[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]。特别是那些能够实现体内NO成像的PA探针具有很大潜力。尽管在NO反应性探针设计方面取得了显著进展，但许多现有PA传感器容易受到血红蛋白、氧合血红蛋白、脂质和黑色素等内源性化合物的干扰，这些化合物在第一个近红外（NIR-I）波段（650–900纳米）吸收强烈，导致背景噪声增加[33]、[34]、[35]、[36]。在第二个近红外（NIR-II）波段（900–1700纳米）具有峰值吸收的探针提供了一个有前景的替代方案，它们具有更好的信噪比、更深的穿透深度和更高的成像对比度[37]、[38]、[39]、[40]、[41]。此外，比率PA探针由于其内置的自校准机制，在高分辨率成像方面具有明显优势，能够减少背景伪影，并提供比传统单输出“开启”型探针更精确的时空分布图[42]、[43]、[44]、[45]、[46]。然而，NO在体内的极短半衰期为体内检测和定量带来了显著挑战。因此，开发一种快速激活、高灵敏度的NIR-II比率PA探针以进行准确的体内NO监测是一个迫切且未满足的需求。

在这项研究中，我们开发了一种NO激活型NIR-II比率PA探针（TCF-BA），用于体内快速、选择性和敏感地检测和可视化NO。TCF-BA由一个发射NIR-II光的阴离子七甲胺花青素发色团和一个作为NO特异性反应位点的苄胺基团组成，基于电子云密度增强策略构建（方案1）。与之前报道的NO激活型PA探针相比，TCF-BA在灵敏度、比率准确性和体内成像能力方面表现出更优的性能（见表S1）。值得注意的是，TCF-BA通过NIR-II范围内的自参考比率测量实现了高对比度的深层组织PA成像。我们进一步通过NIR-II比率PA成像定量追踪了肝毒性小鼠模型中NO水平的波动，证明了该探针的实用性。我们预计这种比率NIR-II PA探针将成为阐明复杂生物环境中涉及NO的病理机制的宝贵工具。

材料与试剂

本研究使用的所有化学品均来自商业渠道，按原样使用。羟基-3-甲基-2-丁酮、2,3,3-三甲基吲哚啉、碘乙烷、环己酮和丙二腈由上海Aladdin Reagent有限公司提供。二甲甲酰胺（DMF）、乙酸乙酯、二氯甲烷（DCM）、四氢呋喃（THF）、甲醇（MeOH）和乙醇（EtOH）由广东Xilong Scientific有限公司提供。乙醇钠（EtONa）和乙酸酐（HAc）也由该公司提供。

NIR-II比率PA探针的设计与合成

为了开发一种具有卓越灵敏度、特异性、时间分辨率和比率PA响应的高性能NO探针，我们设计了一个基于N-硝化反应来调节NIR七甲胺花青素骨架电子推拉效应的比率传感平台。PA探针是通过在花青素骨架中引入一个仲胺基团构建的。

结论

总之，在这项研究中，我们提出了一种通过引入阴离子特性来提高NO激活型PA探针响应速度和灵敏度的通用策略。作为概念验证，我们设计了两种基于七甲胺花青素的探针：阳离子780-BA探针和阴离子TCF-BA探针，以验证这一方法。在NO激活后，这两种探针都发生了N-硝化反应，生成了衍生物（780-BA-NO和TCF-BA-NO），这些衍生物显示出145纳米的显著吸光度变化。

CRediT作者贡献声明

何宗义（Zongyi He）：撰写初稿、数据可视化、方法学设计、实验实施、数据管理。 毕一东（Yidong Bin）：撰写初稿、数据可视化、软件开发、方法学设计、实验实施、数据管理。 黄立贤（Lixian Huang）：撰写初稿、数据可视化、软件开发、实验实施、数据管理。 黄勇（Yong Huang）：审稿与编辑、项目监督、数据分析、概念构建。 赵树林（Shulin Zhao）：审稿与编辑、项目监督、资源协调、方法学设计、论文格式化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国自然科学基金（项目编号：22466008）和广西百色青年拔尖人才项目的支持，特此致谢。

作者简介

毕一东（Yidong Bin）是广西师范大学化学与药学学院的博士生，他的研究兴趣包括纳米材料合成、光声探针和生物成像。