《Sensors and Actuators B: Chemical》：Lighting up POLRMT: Computational Discovery of a Selective and " Off–On " Fluorescent Probe for Cancer Theranostics
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肿瘤中POLRMT过表达与能量代谢相关，靶向该酶可抑制癌细胞增殖。本研究通过结构导向药物设计与分子动力学模拟，开发出首个人源POLRMT靶向荧光探针BMXan–ImPy，基于Folding-PET机制实现“Off-On”信号转换，在结直肠癌模型中验证其特异性成像与治疗潜力。
张伟恒|朱英丽|方彦鹏|尹颖|孟强超|刘倩慧|余倩|陈飞|曾文斌|董杰
中南大学湘雅药学院，中国长沙410083
摘要
人类线粒体RNA聚合酶（POLRMT）是线粒体DNA转录的关键酶，在包括结直肠癌在内的多种肿瘤中经常过度表达，从而促进癌症进展。特异性靶向POLRMT不仅有望抑制癌细胞生长，还为通过直接可视化进行癌症诊断提供了新的分子工具。然而，目前针对POLRMT的成像策略尚不成熟，这限制了其临床应用潜力。为解决这一难题，我们基于折叠-光诱导电子转移（PET）机制设计并表征了一种新型荧光探针。我们的方法结合了结构驱动的药物设计与分子动力学模拟。所得探针BMXan–ImPy由药效团识别单元BMXan与光学模块ImPy组成，其荧光机制通过量子化学计算得到了验证。在自由状态下，BMXan–ImPy处于折叠构象，有利于PET反应，导致荧光淬灭；与POLRMT结合后，这种相互作用会诱导构象展开，阻断PET过程并恢复荧光，实现高度特异性的“关闭-开启”成像。在结直肠癌细胞中的实验研究表明，BMXan–ImPy表现出强烈的生物活性和优良的光学性能。这项工作首次开发出针对POLRMT的诊疗用小分子探针，展示了其在结直肠癌早期诊断和精准治疗中的潜在应用价值。
引言
线粒体是癌细胞能量代谢的核心，主要通过氧化磷酸化（OXPHOS）途径为快速增殖提供能量[1]、[2]、[3]。线粒体DNA（mtDNA）编码重要的OXPHOS组分，其转录异常上调是癌细胞生长和肿瘤进展的关键驱动力[4]、[5]。因此，破坏mtDNA转录可以通过切断癌细胞的能量来源来有效抑制其增殖[6]、[7]。
负责mtDNA转录的关键酶是线粒体RNA聚合酶（POLRMT），它维持线粒体功能并调节细胞代谢[8]、[9]、[10]。越来越多的证据表明，POLRMT在多种恶性肿瘤中过度表达，包括结直肠癌[11]、骨肉瘤[12]、非小细胞肺癌[13]、皮肤鳞状细胞癌[14]、前列腺癌[15]和子宫内膜癌[16]。其表达水平与肿瘤的侵袭性以及癌细胞的增殖、迁移和转移能力密切相关[17]。在结直肠癌中，POLRMT的过度表达不仅促进肿瘤细胞的增殖和迁移，还与化疗耐药性的发展密切相关[18]、[19]。抑制POLRMT可损害线粒体功能，导致能量耗竭、氧化应激和细胞凋亡，同时通过下调Akt-mTOR信号通路抑制癌细胞生长和存活[20]、[21]、[22]。在多种癌症模型中，靶向抑制POLRMT均表现出显著的抗肿瘤效果，凸显了其作为诊疗靶点的巨大潜力[23]、[24]。
尽管POLRMT具有治疗潜力，但在精准医疗应用方面仍存在明显不足：缺乏能够同时实现诊断（成像）和治疗的集成分子工具。这类诊疗试剂的有限可用性限制了其在临床中的广泛应用[25]、[26]、[27]、[28]。此外，传统的基于酶的探针通常依赖水解反应，但由于POLRMT的非水解活性位点，这些探针不适用于POLRMT，给探针设计带来了根本性挑战[29]、[30]、[31]。为克服这一难题，我们设计了一种利用分子内折叠-光诱导电子转移（PET）机制的新型“关闭-开启”荧光探针[32]、[33]。在自由状态下，探针处于折叠构象，有利于识别单元与光学模块之间的PET反应，导致荧光淬灭；与POLRMT结合后，这种相互作用会诱导构象展开，阻断PET过程并恢复荧光，实现高度特异性的光学信号。实验表明，BMXan–ImPy在结直肠癌细胞中表现出强大的生物活性和优良的光学特性。
部分内容
线粒体在癌细胞的能量代谢中起着核心作用，主要通过氧化磷酸化（OXPHOS）途径为快速增殖提供能量[1]、[2]、[3]。线粒体DNA（mtDNA）编码重要的OXPHOS组分，其转录异常上调是癌细胞生长和肿瘤进展的关键驱动因素[4]、[5]。因此，破坏mtDNA转录可通过切断癌细胞的能量来源来有效抑制其增殖[6]、[7]。
负责mtDNA转录的关键酶是线粒体RNA聚合酶（POLRMT），它维持线粒体功能并调节细胞代谢[8]、[9]、[10]。多项研究表明，POLRMT在多种恶性肿瘤中过度表达，包括结直肠癌[11]、骨肉瘤[12]、非小细胞肺癌[13]、皮肤鳞状细胞癌[14]、前列腺癌[15]和子宫内膜癌[16]。其表达水平与肿瘤的侵袭性以及癌细胞的增殖、迁移和转移能力密切相关[17]。在结直肠癌中，POLRMT的过度表达不仅促进肿瘤细胞的增殖和迁移，还与化疗耐药性的发展密切相关[18]、[19]。抑制POLRMT可损害线粒体功能，导致能量耗竭、氧化应激和细胞凋亡，同时通过下调Akt-mTOR信号通路抑制癌细胞生长和存活[20]、[21]、[22]。在多种癌症模型中，靶向抑制POLRMT均表现出显著的抗肿瘤效果，表明其作为诊疗靶点的巨大潜力[23]、[24]。
尽管POLRMT具有治疗潜力，但在精准医疗应用方面仍存在明显不足：缺乏能够同时实现诊断（成像）和治疗的集成分子工具。这类诊疗试剂的有限可用性限制了其在临床中的广泛应用[25]、[26]、[27]、[28]。此外，传统的基于酶的探针通常依赖水解反应，但由于POLRMT的非水解活性位点，这些探针不适用于POLRMT，给探针设计带来了挑战[29]、[30]、[31]。为克服这一难题，我们设计了一种利用分子内折叠-光诱导电子转移（PET）机制的新型“关闭-开启”荧光探针[32]、[33]。在自由状态下，探针处于折叠构象，有利于识别单元与光学模块之间的PET反应，导致荧光淬灭；与POLRMT结合后，这种相互作用会诱导构象展开，阻断PET过程并恢复荧光，实现高度特异性的光学信号[35]、[36]。这种基于折叠-PET的探针设计需要综合考虑多个因素，包括药效团和光学模块的电子性质、构象转变的驱动力以及连接子的长度和灵活性[37]。传统上，探针开发依赖于化学家的经验知识，这可能导致有潜力的结构特征被忽略[38]、[39]。
近年来，计算机辅助药物设计（CADD）技术的快速发展[40]、[41]为分子探针的开发提供了强大的理论和技术支持[42]、[43]、[44]。在本研究中，我们利用已报道的POLRMT晶体结构（PDB ID: 7A8P）对其活性口袋和别构位点进行了系统分析，以确定潜在的探针结合位点。设计POLRMT探针的一个主要挑战是缺乏合适的配体抑制剂。现有POLRMT抑制剂的结构相对固定且化学类型有限，难以直接应用于探针设计。为克服这一限制，我们利用高活性化合物的结构数据和别构口袋的特征构建了药效团模型，用于筛选能与POLRMT相互作用的识别基团。由于POLRMT具有非水解活性位点，传统的基于酶的探针（依赖水解切割）不适用。为此，我们采用折叠-PET机制设计荧光探针，实现无需酶切割的构象切换和荧光调控。通过分子对接评估候选识别基团与POLRMT的结合模式，随后通过分子动力学模拟验证其构象稳定性和结合持久性。这一步骤至关重要，以确保探针在复杂生物环境中保持稳定构象并有效靶向POLRMT。通过迭代优化，我们确定BMXan作为具有高结合选择性的药效团识别基团，ImPy作为具有优良光物理特性的光学模块。为确保其有效激活折叠-PET机制，我们进行了量子化学计算，优化了它们的电子结构、能级分布和构象驱动力。结果表明，BMXan和ImPy在自由状态下保持折叠构象，促进电子转移和荧光淬灭；与POLRMT结合后诱导构象展开，阻断电子转移并恢复荧光。最终，这种多级结构驱动的药物设计策略结合分子动力学模拟和量子化学计算，成功设计并构建了首个针对POLRMT的“关闭-开启”荧光探针BMXan–ImPy（见图1）。这种分子工具不仅能够特异性识别和可视化POLRMT，还具有诊疗潜力，为结直肠癌的精准诊断和治疗提供了新的策略和技术基础。
部分内容片段
BMXan–ImPy结合位点的鉴定
使用MOE 2019系统筛选了POLRMT的潜在结合位点。通过将受体原子作为目标，利用Site Finder模块识别蛋白质表面的潜在配体结合口袋。根据基于属性似然（PLB）的评分对候选口袋进行排序，并选择得分最高的口袋。结构分析显示，该口袋位于POLRMT的别构调控区域，距离已报道的功能性别构位点约9 ?BMXan–ImPy结合位点的确定及光学模块的筛选
基于已报道的POLRMT–IMT1B复合物（PDB ID: 7A8P）晶体结构，IMT1B作为一种构象诱导的别构抑制剂，与POLRMT的调控别构口袋结合并完全占据该区域，有效阻断其催化活性。鉴于光学模块在决定荧光探针成像性能和靶向特异性中的关键作用，我们系统探讨了已知别构位点附近的潜在结合位点结论
在本研究中，我们成功设计并构建了一种“关闭-开启”荧光探针BMXan–ImPy，专门针对POLRMT。据我们所知，这是首个具备POLRMT特异性识别和可视化功能的分子工具，同时具备诊断和治疗潜力。我们的研究结果展示了BMXan–ImPy的显著优势和广阔的诊疗前景。
CRediT作者贡献声明
孟强超：验证、数据分析。尹颖：验证、数据分析。方彦鹏：软件开发、数据分析。曾文斌：写作、审稿与编辑、项目管理、资源协调。陈飞：写作、审稿与编辑、资源协调。余倩：写作、审稿与编辑、资源协调。刘倩慧：写作、审稿与编辑、软件开发。朱英丽：初稿撰写、可视化处理、验证、软件应用、方法学研究、数据分析。张伟恒：
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（NSFC）（82272067）、中南大学创新驱动项目（2023CXQD004）、湖南省科技创新计划（2024RC3004）以及中南大学研究生创新基金（2025ZZTS0990）的支持。
张伟恒（第一作者）是中南大学湘雅药学院副教授董杰指导下的硕士研究生，主要从事荧光探针开发和计算机辅助药物设计研究。
