《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Plasmon enhanced CuS@Au Nanozyme assisted dual mechanism colorimetric monitoring of food freshness at near-neutral pH
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本研究开发出金包覆铜硫化物（CuS@Au）纳米酶，具有过氧化酶模拟活性，可在生理pH下高效催化，并成功应用于水产品新鲜度检测（xanthine）和维生素C（ascorbic acid）检测，展现出宽线性范围（0-750 μM和10-200 μM）及低检测限（1.42 μM和2.4 μM），同时验证了其在复杂基质中的高特异性与灵敏度。
Ragini Singh|Qinghua Zeng|Huibo Han|Gudivada Nithin|Kamini Sneha Sameera|Carlos Marques|Santosh Kumar
印度安得拉邦Vaddeswaram，Koneru Lakshmaiah教育基金会生物技术系，邮编522302
摘要
纳米酶因其作为天然酶替代品在多种生物医学应用中的潜力而受到越来越多的关注，这些应用包括生物传感、催化和免疫测定。传统的生物传感方法由于方法复杂且成本高昂，面临诸多挑战，从而限制了其在现场检测中的应用。为克服这些挑战，我们开发了一种具有过氧化物酶模拟活性的金包覆硫化铜（CuS@Au）纳米酶。相关研究支持了这一观察结果，这可能是由于Cu+(d10)和Au+(d10)之间的非共价金属亲和相互作用。在H2O2存在下，使用显色底物TMB评估并验证了其过氧化物酶模拟活性，结果符合Michaelis-Menten酶动力学方程。与许多已报道的纳米酶相比，所开发系统的优势在于其在生理pH值下仍具有催化潜力，这在生物系统中尤为重要。该纳米酶还被用作比色生物传感器，用于快速灵敏地检测生物基质中的黄嘌呤和抗坏血酸。比色传感主要基于黄嘌呤（存在黄嘌呤氧化酶时）和抗坏血酸对TMB氧化的促进或抑制作用。结果表明，黄嘌呤和抗坏血酸的线性检测范围分别为0–750 μM和10–200 μM，检测限分别为1.42 μM和2.4 μM。此外，该比色方法在真实样品中也高效地用于黄嘌呤和抗坏血酸的检测，并具有较高的回收率。总体而言，CuS@Au纳米酶表现出显著的过氧化物酶样活性，具有成本效益高、效率高等特点，为监测黄嘌呤和抗坏血酸提供了一种有效且灵敏的方法。
引言
随着人口的增长，水产品作为蛋白质的丰富来源，需求也在不断增加。由于水产品的保质期有限且易腐烂，评估其质量对于确保消费者获得安全高质量的产品至关重要[1]、[2]。研究表明，鱼类死亡后，体内的三磷酸腺苷（ATP）会降解产生黄嘌呤，其浓度会随储存时间的延长而增加。因此，黄嘌呤的检测已成为监测鱼类新鲜度和保持产品质量的重要参数[3]。此外，黄嘌呤的检测还具有重要的临床意义，因为摄入富含黄嘌呤的肉类会导致严重的健康问题，如肾功能衰竭、痛风、高尿酸血症和黄嘌呤尿[4]。
其次，抗坏血酸（AA，维生素C）是一种重要的抗氧化剂和神经调节剂[5]。多项研究表明，人体内抗坏血酸水平异常会增加患帕金森病、阿尔茨海默病、心血管疾病和某些类型癌症等严重疾病的风险[6]、[7]。由于人体无法通过代谢合成抗坏血酸，这些必需化合物必须从食物和饮料等外部来源获取[8]。因此，准确量化食品样品中的抗坏血酸含量至关重要，因为它直接影响食品的质量和安全性。除了生物学功能外，抗坏血酸还广泛应用于食品工业、化妆品和各种药品中。在质量控制、健康监测和临床诊断等领域，准确且便捷地检测抗坏血酸的重要性日益受到关注[9]。目前有多种传统方法可用于分析样品中的黄嘌呤和抗坏血酸，包括气相色谱、质谱、高效液相色谱（HPLC）和碎片化技术[10]、[11]、[12]。然而，这些技术存在成本高、样品制备复杂、耗时以及需要经验丰富的操作人员等缺点，无法满足现代对紧凑型便携式生物传感器的需求。因此，迫切需要开发成本低、操作简便且具有便携性的新技术。
在上述背景下，比色方法具有显著的优势，如成本低廉、易于使用以及能够进行现场分析。目标浓度引起的颜色变化可以用肉眼轻松观察到，无需昂贵的复杂仪器[13]。在比色生物传感中，辣根过氧化物酶（HRP）曾是首选酶，但由于稳定性差、成本高和产量有限，其应用受到限制。纳米酶由于其高稳定性、低成本和易于合成等优点，成为克服这些缺点的好选择[14]。纳米酶由于其表面特性和较多的反应位点而表现出高催化活性。此外，可以通过调节纳米酶的表面和活性来实现可控、改进和特定的催化反应[15]。如今，已知多种纳米材料具有过氧化物酶模拟活性，例如AuNPs[16]、CuO纳米颗粒[17]、WO3纳米片[18]和Au-MoS2纳米复合材料[19]，并可成功应用于生物传感。
类似地，利用具有显著过氧化物酶模拟活性的纳米酶的比色传感方法已被提出，用于快速灵敏地检测黄嘌呤和抗坏血酸。Qiao等人使用Se-g-C3N4纳米片的过氧化物酶模拟活性证明了黄嘌呤的可靠和灵敏检测[20]。作者发现，在黄嘌呤氧化酶存在下，随着黄嘌呤浓度的增加，TMB的蓝色强度增强。Song等人合成了PtAu/PCN/S-rGO双原子纳米复合材料，并将其用于黄嘌呤的灵敏快速比色检测[21]。虽然这些基于纳米酶的比色方法在检测黄嘌呤方面表现出显著效果，但大多数纳米酶的合成过程耗时且复杂，合成温度过高，严重限制了其在生物分析中的应用。
基于金（Au）的纳米材料以其可调的物理和化学性质以及不同的催化活性而闻名，使其成为生物医学和传感应用的理想选择[22]。多项研究报道了它们在生物分子和重金属离子传感中的高效应用[22]、[23]、[24]。然而，它们容易聚集，因此需要设计具有更高稳定性的金包覆纳米材料。为了解决这一问题，可以在金属硫化物表面沉积AuNPs，从而在AuNPs和金属硫化物表面的硫之间形成强键，这不仅提供了稳定性，还提高了催化性能[25]。近年来，硫化铜（CuS）纳米颗粒因其稳定性和优异的过氧化物酶模拟活性而在比色传感应用中受到广泛关注[26]。因此，金包覆的硫化铜纳米颗粒（CuS@Au）有望成为具有增强催化活性和稳定性的有效生物传感方法。
基于CuS或Au的具有过氧化物酶样活性的纳米酶已广泛用于比色传感，但大多数这类系统仅在强酸性环境中发挥作用[27]，并且主要用于单一分析物（如单宁酸、葡萄糖、汞离子、多巴胺等）的检测[22]、[23]、[24]、[28]、[29]。因此，这些研究主要展示了CuS和Au纳米酶在酸性pH值下的应用。此外，它们在复杂食品基质中的应用（相关pH值）尚未得到充分研究。本文报道了一种新型的等离子体增强型CuS@Au纳米酶，通过黄嘌呤氧化酶介导的策略和基于氧化还原化学的抗坏血酸检测，实现食品新鲜度的双重机制比色检测。
图1提出了制备金包覆硫化铜纳米颗粒（CuS@Au）的简单便捷合成方法。所制备纳米酶的过氧化物酶模拟活性被用于黄嘌呤和抗坏血酸的快速灵敏比色检测。传感原理主要基于黄嘌呤存在下生成•OH自由基，以及抗坏血酸对•OH的自由基的清除作用，从而导致蓝色氧化TMB的产生或抑制，从而产生可检测的蓝色。结果通常显示，黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤生成过氧化氢（H2O2），进而氧化显色底物TMB产生蓝色。相反，抗坏血酸作为抗氧化剂，可以降低氧化TMB的蓝色强度，因为其能够淬灭形成的OH•。该工程纳米材料的结构和形态特性、催化性能、反应动力学及作用机制也进行了研究。进一步观察到，所开发的生物传感系统对黄嘌呤和抗坏血酸具有快速灵敏的检测能力，并具有高特异性。单一纳米酶平台在接近中性pH值下的高效性能以及平台上同时测定多种新鲜度指标的特点，突显了本研究的新颖性和实用性。
硫化铜（CuS）纳米颗粒的合成
按照报道的协议对CuS纳米颗粒进行了合成，并进行了少量修改[30]。简要来说，将0.68 mM的柠檬酸钠与1 mM的氯化铜（CuCl2）混合在1000 mL的总体积中，然后加入1 M的硫化钠（1 mL），并在室温下搅拌。混合物在90°C下加热10分钟后继续搅拌，直至形成深绿色。最后，将混合物转移到冰水中，得到的CuS纳米颗粒在4°C下储存以备进一步使用。
CuS@Au的表征
通过一步水热法使用柠檬酸钠合成了亲水性CuS纳米颗粒，并在其表面生长AuNPs，得到最终的CuS@Au纳米复合材料。使用HRTEM成像对制备的纳米酶的形态和尺寸进行了表征，如图1A所示。结果表明，CuS@Au纳米酶已成功合成，并在溶液中分散良好，呈不规则的球形。平均粒径通过ImageJ软件测量。
结论
总之，我们成功开发了具有增强过氧化物酶模拟活性的CuS@Au纳米酶，这得益于CuS–Au界面处高效的电子转移。与许多已报道的纳米酶相比，所开发系统的优势在于其在生理pH值下仍具有催化潜力，这在生物系统中尤为重要。催化活性归因于Fenton反应产生的•OH自由基。黄嘌呤和抗坏血酸的作用...
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了Anusandhan国家研究基金会（ANRF/ARG/2025/003993/LS）和印度Koneru Lakshmaiah教育基金会的支持。此外，该研究还得到了欧盟REFRESH项目（项目编号CZ.10.03.01/00/22003/0000048）的财政支持，该项目属于“区域可持续性和高科技产业研究卓越”计划的一部分。
