Hypericum vermiculare和Salvia officinalis对黄曲霉（Aspergillus flavus）中黄曲霉素B（aflatoxin B）的产生及其相关调控基因表达的抑制作用

《South African Journal of Botany》：Hypericum vermiculare and Salvia officinalis inhibitory effects on aflatoxin B 1 production and regulatory genes expression in Aspergillus flavus

黄曲霉毒素B1抑制研究： hypericum vermiculare和salvia officinalis精油通过抑制ergosterol合成及下调aflR/aflS基因表达，有效抑制非洲木霉的生长和毒素产生。

　　

Mahsa Rezaei | Masoomeh Shams-Ghahfarokhi | Mehdi Razzaghi-Abyaneh

伊朗德黑兰塔比亚特莫达雷斯大学医学院真菌学系，邮编14115-331

摘要

黄曲霉毒素B1（AFB1）是一种强效的I型肝癌致癌物，由于其与人类和动物的肝癌及急性黄曲霉毒素中毒有关，因此对全球健康构成了重大威胁。本研究旨在评估贯叶连翘（Hypericum vermiculare，简称HVEO）和圣罗勒（Salvia officinalis，简称SOEO）精油对黄曲霉（Aspergillus flavus）的生长、麦角甾醇合成、AFB1的产生以及黄曲霉毒素生物合成基因表达的联合抑制作用。这两种精油的化学成分通过气相色谱/质谱（GC/MS）技术进行了测定。将产生AFB1的黄曲霉接种在酵母提取物-蔗糖（YES）培养基中，并在28°C下用两种不同浓度的植物精油（62.5–2000 μg/ml）处理4天。以菌丝生物量为指标来衡量真菌生长情况。通过分光光度法测定菌丝中的麦角甾醇含量，通过高效液相色谱（HPLC）分析确定AFB1的含量。通过定量实时PCR技术评估aflR和aflS调控基因的表达情况。GC–MS分析显示，HVEO的主要成分是α-蒎烯（45.3%）和长叶烯（14.19%），而SOEO则富含樟脑（31.78%）和1,8-桉叶油醇（22.30%）。在1000 μg/mL浓度下，SOEO显著抑制了真菌生长和麦角甾醇含量，破坏了菌丝的膜结构并降低了AFB1的产生；相比之下，HVEO的抑制效果较弱。HVEO使aflR和aflS的表达分别降低了3.7倍和2.8倍，而SOEO则分别降低了2.9倍和2.3倍。本研究首次证明了HVEO和SOEO能够抑制黄曲霉中的aflR和aflS基因表达，从而将其GC–MS鉴定出的化合物与抗黄曲霉毒素作用联系起来。通过抑制黄曲霉的生长和AFB1的产生（通过减少麦角甾醇合成及下调aflR和aflS基因表达），为圣罗勒和贯叶连翘作为控制农作物和食品中真菌污染的有希望的候选物质提供了基于证据的信息。

引言

产生黄曲霉毒素的真菌因其能够污染多种农产品而变得越来越重要。黄曲霉毒素（AFs）是一类多酮衍生物代谢物，被认为是霉菌毒素中最有毒和最具致癌性的化合物（Razzaghi-Abyaneh等人，2023年）。这些次级代谢物主要由黄曲霉属（Aspergillus）的某些物种产生，尤其是黄曲霉（A. flavus）和寄生黄曲霉（A. parasiticus），已知与人类和动物的肝细胞癌有关。此外，它们还会对农业和食品产业造成严重的经济损失。长期摄入黄曲霉毒素，尤其是其中毒性最强的黄曲霉毒素B1（AFB1），可能导致严重的DNA损伤和多种慢性健康问题（Yu，2012年）。鉴于其严重的健康和经济影响，包括世界贸易组织（WTO）在内的全球监管机构已经制定了严格的食品中黄曲霉毒素含量限值。黄曲霉毒素在食品和饲料中的持续存在给农业和食品产业带来了巨大的经济损失，这凸显了迫切需要有效的缓解策略（Mahato等人，2019年）。

黄曲霉中的黄曲霉毒素生物合成是一个高度协调的过程，由位于3号染色体上、距离端粒约80 kb处的30多个结构基因控制。这个54 kb的黄曲霉毒素基因簇包含核心酶基因，如aflD（nor-1）、aflM（ver-1）和aflP（omtA），这些基因编码关键途径酶，但其整体激活主要由两个核心调控基因aflR和aflS控制。由于aflR/aflS调控模块是整个基因簇转录激活的主要开关，因此它们表达的变化可以作为早期和可靠的途径抑制指标（Abbas等人，2024年；Yu，2012年）。

已经探索了多种化学、物理和生物策略来控制黄曲霉毒素污染，包括合成杀菌剂和物理解毒方法（Al Khoury等人，2022年；Han等人，2022年；Tan等人，2022年；Razzaghi-Abyaneh等人，2011年）。然而，由于环境暴露和过度使用导致的抗真菌耐药性的增加，许多合成剂的效果已经减弱（Verweij等人，2020年）。此外，公众对合成化学品的健康和环境风险的担忧加速了对更安全、更环保替代品的兴趣。在这种情况下，植物来源的天然产物作为控制霉菌毒素的有希望的工具受到了关注（Ahmad等人，2022年；Heidary等人，2022年）。精油（EOs）和植物提取物富含多种次级代谢物，如萜类化合物、黄酮类和酚酸，这些化合物具有抗菌、抗氧化和抗炎作用（You等人，2025年；de Elguea-Culebras等人，2023年；Rao等人，2022年；Takó等人，2020年；Tsuchiya，2015年）。值得注意的是，一些精油已被报道能够抑制aflR和aflS的表达，从而减少黄曲霉和寄生黄曲霉中的AFB1产生（Youssef等人，2021年；Oliveira等人，2020年；Moon等人，2018年；Liang等人，2015年）。除了在基因水平上的调控外，这些生物活性化合物还可能通过干扰麦角甾醇合成来破坏真菌膜的完整性，进一步削弱真菌的生存能力。

鼠尾草属（Salvia）和贯叶连翘属（Hypericum）的物种在传统医学中得到广泛应用，以其广泛的药理作用而闻名（Alahmad等人，2022年；Assaggaf等人，2022年；Ja?o等人，2023年；Shakya等人，2019年）。圣罗勒（Salvia officinalis）以其抗炎、抗菌和抗氧化特性而闻名（Martins等人，2014年；欧洲药品管理局：EMA，2009年）。其精油和有机溶剂提取物含有多种生物活性成分，如迷迭香酸、肉桂酸、松油醇、樟脑以及多种黄酮类和酚酸（Mohammed等人，2021年；Ghorbani和Esmaeilizadeh，2017年；Veli?kovi?等人，2011年）。同样，贯叶连翘属（Hypericum）物种也表现出显著的药理作用，包括抗菌、促进伤口愈合、抗炎和抗病毒效果（You等人，2025年；Mohamed等人，2022年；Shakya等人，2019年；Tocci等人，2013年）。欧盟关于贯叶连翘的专论的采用标志着欧洲共同体内部草药产品标准化进程的一个里程碑。野生生长在伊朗（库尔德斯坦省）的贯叶连翘富含生物活性分子，如金丝桃素、伪金丝桃素、超金丝桃素、单宁和多种酚酸（Jaimand等人，2013年）。这些化合物被认为通过破坏细胞膜、生成活性氧（ROS）和干扰核酸合成来发挥抗菌作用（Alahmad等人，2022年；Assaggaf等人，2022年）。然而，尽管它们具有巨大的药理潜力，但贯叶连翘和圣罗勒的抗真菌机制，特别是在基因调控和黄曲霉毒素生物合成方面的机制仍需进一步研究。

本研究旨在阐明贯叶连翘和圣罗勒精油的抗真菌和抗霉菌毒素潜力，以及它们在开发基于植物的食品安全干预措施方面的潜在贡献。在这方面，本研究重点关注：（i）精油对真菌生长和存活能力的影响；（ii）精油抑制麦角甾醇合成从而衡量真菌细胞膜完整性的能力；（iii）精油减少AFB1产生的能力；（iv）精油对aflR和aflS基因表达的影响，作为黄曲霉毒素生物合成途径的分子标志物。通过这种综合方法，将表型、生化和分子评估联系起来。

精油（EOs）的植物种类和制备

使用了存放在森林与草原研究所的贯叶连翘（H. vermiculare）Boiss. & Hausskn（标本编号P900419）和存放在伊朗生物资源中心的圣罗勒（S. officinalis）L.（标本编号IBRC P1007120）。从每种植物的风干地上部分（100克）中使用Clevenger型装置和500毫升蒸馏水进行水蒸馏提取精油，每种植物重复三次。提取的精油储存在4°C的暗处小瓶中。

HVEO和SOEO的植物化学成分

通过GC–MS测定的HVEO和SOEO的化学成分见表1。HVEO和SOEO的GC–MS色谱图见补充图S1和S2。HVEO中共鉴定出23种化合物，其中α-蒎烯（45.3%）和长叶烯（14.19%）是主要成分。在SOEO中检测到19种化合物，樟脑（31.78%）、1,8-桉叶油醇（22.30%）和α-松油醇（19.80%）是主要成分。

HVEO和SOEO对黄曲霉（A. flavus）的抗真菌活性

如图1所示，HVEO和SOEO均表现出...

讨论

我们本研究的结果揭示了HVEO和SOEO的化学组成，为观察到的黄曲霉生长抑制、麦角甾醇产生减少、菌丝超微结构损伤以及aflR/aflS表达下降提供了机制上的联系。此外，透射电子显微镜（TEM）观察到的膜损伤和线粒体嵴的丧失与精油中的单萜类化合物靶向膜的作用一致，可能导致下游次级代谢（包括AFB1）的抑制。

结论

总之，HVEO和SOEO对黄曲霉表现出强大的抗真菌和抗黄曲霉毒素活性，形态学上表现为抑制真菌孢子形成，AFB1的产生减少了72–85%，真菌干重减少了58–73%。据我们所知，这是首次将HVEO和SOEO与黄曲霉中aflR和aflS基因的转录抑制联系起来的报道。aflR和aflS基因的下调表明抑制了该调控途径。

资助声明

本项工作得到了塔比亚特莫达雷斯大学研究部的财政支持（资助编号：MED-89372）。

伦理批准

本文不包含任何作者进行的涉及人类参与者或动物的研究。

CRediT作者贡献声明

Mahsa Rezaei：撰写——初稿、研究。Masoomeh Shams-Ghahfarokhi：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、验证、监督、方法学、数据管理、概念化。Mehdi Razzaghi-Abyaneh：撰写——审阅与编辑、可视化、资源管理、项目协调、正式分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。