《Toxicon: X》：In vitro-
in vivo discord: a preclinical study of AZD2716 and its racemate with comparison to varespladib for the development of snake venom sPLA2 inhibitors.
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本文推荐研究人员为解决蛇伤治疗中小分子sPLA2（分泌型磷脂酶A2）抑制剂从体外到体内疗效转化不一致的问题，开展了一项临床前研究。研究对比了候选药物AZD2716（R-对映体及其外消旋体）与先导化合物varespladib的体外抑制活性与体内小鼠救治效果。结果发现，尽管所有化合物在体外均表现出纳摩尔至皮摩尔的强效IC50值，但在严格的GLP（良好实验室规范）标准下，AZD2716系列在体内未能提供与varespladib同等的生存优势。这项研究强调了在药物候选物筛选及进入临床开发前，必须进行临床前体内研究以验证体外活性的重要性。
每年，超过500万人被蛇咬伤，其中估计有13.8万人死亡。当前主要依赖静脉注射的抗体类抗蛇毒血清，这通常限制了治疗的适用场景，需要较完善的医疗条件和受过培训的临床人员。据统计，约75%的蛇伤死亡发生在患者抵达最终救治点之前。因此，一种能够在“咬伤发生时刻”及时使用的治疗手段，仍是一个未被满足的迫切需求。近年来，针对蛇伤中毒的几种小分子疗法（SMTs）的动物研究显示出巨大潜力。它们有望解决院前初始治疗的问题，缩短救治时间，这相比现有的抗体疗法是一个重要的潜在优势。这些小分子药物因其能强效抑制一些重要且广泛保守的毒素成分、储存稳定性好、生产成本较低以及给药方式便捷（包括口服途径）而备受关注。
在众多可成药的蛇毒靶点中，分泌型磷脂酶A2（sPLA2）类别是最引人注目的之一。这类毒素功能多样、毒性高，且普遍存在于超过95%的毒蛇物种的毒液中。蛇毒sPLA2s是“多功能”毒素，能够引起多种毒性症状，包括神经毒性、溶血、凝血功能障碍、细胞毒性和剧痛等。最近，一种名为varespladib的“老药新用”小分子药物，因其能强效且广谱地抑制蛇毒PLA2s，在小鼠和猪的神经毒性及血/细胞毒性中毒救治模型中显示出预防或延缓致死性的效果，展现了作为蛇伤辅助疗法的强大潜力。Varespladib及其口服生物可利用的前药varespladib-methyl，近期已在美国和印度完成了II期临床试验。
Varespladib与阿斯利康开发的另一系列sPLA2抑制剂化合物原本是同时代开发用于心血管疾病的。这些化合物据报告与varespladib效力相似，但在varespladib的VISTA-16试验因中期分析显示无效及长期使用的安全性问题而提前终止后，相关开发也被放弃。然而，AZD系列化合物中，尤其是AZD2716所报告的某些特性引起了研究人员的兴趣：其研究者称，AZD2716的稳定性和口服渗透性可能优于varespladib等其他sPLA2抑制剂。报告显示，AZD2716在其原型状态下，在大鼠和狗中的口服生物利用度超过80%（相比之下，varespladib在其研究中的生物利用度约为48%）。生物利用度对于开发优化的“咬伤时刻”口服小分子疗法而言是一个重要考量。研究人员推断，AZD2716的高口服生物利用度可能有助于更快速的现场给药，并有可能降低生产成本，从而改善蛇伤中毒的整体管理。
为了理解两种效力相似的药物在中毒环境下的表现差异，本研究系统评估了AZD2716（包括其外消旋体和R-对映体）的体外抑制潜力，并在一项延迟给药的体内小鼠救治研究中，测试了其对4种不同蛇毒的中毒效果。本研究旨在将AZD2716与varespladib进行比较，实验模型选用了先前已证明varespladib能提高动物生存率的蛇伤模型。所有研究均在一家合同研究实验室按照GLP标准进行。
为了开展研究，作者主要采用了以下几项关键技术方法：首先是利用以1,2-双（庚酰）甘油磷酰胆碱为底物的体外sPLA2活性抑制实验，通过检测底物水解产生的游离巯基（使用DTNB，即5,5-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)）来评估化合物对多种蛇毒（来源自五大洲26种具有重要医学意义的蛇种）的半数抑制浓度（IC50）。其次，在体内研究中，作者构建了小鼠延迟给药救治模型，使用东部珊瑚蛇（Micrurus fulvius）、海岸太攀蛇（Oxyuranus scutellatus）、莫哈韦响尾蛇（Crotalus scutulatus）和圆斑蝰（Daboia russelii）这四种高sPLA2活性蛇毒，通过皮下或腹腔注射方式使小鼠中毒，随后在规定时间窗内（中毒后10分钟内）静脉注射或口服（两次给药）给予待测化合物，并持续监测动物生存情况和临床症状。数据分析方面，体外IC50值经对数转换为pIC50后进行统计学比较；体内生存数据则采用Kaplan-Meier生存分析、Log-rank检验、Holm-Sidak多重比较以及限制性平均生存时间（RMST）分析等非参数统计方法进行评估。
体外抑制实验结果
研究人员首先在体外sPLA2活性实验中测试了AZD2716、其外消旋体（“化合物7”）和varespladib的效果。结果显示，AZD2716及其外消旋体与varespladib的抑制效力相当，IC50浓度均在低纳摩尔至皮摩尔范围。对所有抑制剂在同一组蛇毒样本中进行剂量反应曲线测试后，计算出的平均pIC50为：varespladib 12.6 ± 1.2，AZD2716 11.7 ± 0.9，AZD外消旋体 11.1 ± 0.9。对应的IC50值分别为：varespladib 2.5 x 10-13M，AZD2716 2.0 x 10-12M，AZD外消旋体 7.9 x 10-12M。统计分析表明，varespladib的平均效力显著高于AZD2716或其外消旋体。此外，在所测试的毒液中，对于AZD2716及其外消旋体，蝰科蛇毒趋向于比眼镜蛇科蛇毒具有更高的pIC50值（即抑制力更强），但此趋势未达到统计显著性。
体内小鼠研究结果
研究人员测试了AZD2716、其外消旋体和varespladib对四种蛇毒（东部珊瑚蛇、海岸太攀蛇、莫哈韦响尾蛇、圆斑蝰）引起急性中毒的治疗效果。无论是静脉注射还是口服给药途径，在所有测试的蛇种中，varespladib都表现出最大的生存获益。相比之下，AZD2716与其外消旋体提供的生存改善效果相当，但均不及varespladib。当将所有物种的生存数据汇总进行盲法分析时，结果显示，与仅接受蛇毒的对照组相比，所有测试化合物均能显著提高生存率。其中，varespladib提供的生存优势最强，而AZD2716与其外消旋体之间则未检测到统计学上的显著差异。
限制性平均生存时间分析结果
为进一步量化治疗效果，研究采用了限制性平均生存时间分析。在静脉给药方案中，varespladib带来了最大的RMST改善（平均ΔRMST为694分钟）。AZD外消旋体提供的生存获益总体较短，且对不同科属蛇毒的效果差异较大。AZD2716在眼镜蛇科毒液模型中的效果微乎其微（ΔRMST +44分钟），但对蝰科毒液则提供了明确的益处（+524分钟）。在口服给药方案中，varespladib同样带来了最大的生存优势（ΔRMST +695分钟）。AZD2716对眼镜蛇科毒液意外地效果不佳（ΔRMST +155分钟），但对测试的蝰科毒液则明显更有效（ΔRMST +535分钟）。相比之下，其外消旋体对两类毒液的RMST改善均不及AZD2716。
按蛇毒类型的体内生存结果
具体到每种蛇毒：对于东部珊瑚蛇毒，varespladib（静脉和口服）能显著提高生存率，而AZD2716及其外消旋体则效果有限。对于海岸太攀蛇毒，所有接受varespladib治疗的动物均存活至研究结束，而AZD化合物提供的保护作用有限。对于莫哈韦响尾蛇毒，所有化合物均能显著提高生存率，varespladib口服组全部存活。对于圆斑蝰毒，所有化合物似乎都能延长生存期，其中varespladib静脉给药的效果最佳。
研究结论与讨论
本研究评估了AZD2716及其外消旋体对来自五大洲的蛇毒样本的体外抑制潜力，并比较了它们与varespladib在小鼠体内模型中的生存效果。这项研究向毒素学领域引入了第二类“老药新用”的高效合成sPLA2抑制剂。尽管阿斯利康因varespladib的VISTA-16临床试验结果而放弃了AZD2716系列的开发，且早期报告显示AZD2716在动物模型中具有更高的口服生物利用度，但本研究发现，在严格的GLP条件下进行的体内救治研究中，这些非吲哚类sPLA2抑制剂并未能转化为与varespladib（一种取代吲哚）一致的生存优势。
体外与体内疗效之间的差异凸显了药物开发中的重要考量。虽然AZD2716（R-对映体）在体外被证明是强效的，但在这些初步的动物研究中，其对生存的影响并不一致。可能的原因包括：体外实验暴露条件是恒定的，不受活体生物的药代动力学和药效学影响；varespladib与AZD化合物在结构上存在差异，例如varespladib具有刚性的吲哚骨架，而AZD化合物则具有较大的自由度，这可能影响了它们在体内与sPLA2的相互作用；不同的代谢途径（代谢通常具有对映体选择性）以及分布或排泄差异也可能导致疗效不一。
AZD2716仅有一个手性中心，因此只有两个对映体。虽然之前的研究表明AZD2716是其系列中最有效的，但手性因素是否是其在小鼠模型中疗效较差的原因尚不清楚。如果未来要推进此类候选药物，开发者可能会考虑开发成本更低的外消旋体，而非增加昂贵的手性分离步骤。本研究的局限性包括仅为单项研究、未测试AZD系列中的所有化合物、未进行剂量探索分析，且体内研究仅考察了生存率，未评估血液学异常纠正、肾功能保护或组织损伤等亚致死效应。尽管如此，这项研究强调了药物开发中的几个重要考量——最重要的是，化合物之间在体外表现出的相似性，可能无法转化为临床前体内评估中的生存优势。因此，在筛选先导化合物并推进至临床开发时，必须在体外抑制实验之后进行临床前研究加以验证。将新的sPLA2抑制剂加入研究人员的工具箱，仍可能带来尚未被认知的益处。
本研究论文发表在《Toxicon: X》期刊上。
