《SCIENCE ADVANCES》：Accessory microRNA byproducts expand RNA interference via microprocessor-mediated cleavage activation
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本研究针对RNA疗法在遗传复杂疾病（如癌症）中因依赖多异常通路而面临的挑战，开发了一种创新的微RNA平台。该平台利用微RNA加工中先前未识别的特征，通过依赖微处理器的切割激活策略，能够同时上调和下调所需微RNA，并可作为其他短链非编码RNA的结构性载体。研究人员在胶质母细胞瘤模型中验证了其潜力，通过同时双向调控五个高度失调的微RNA，实现了对肿瘤的“临界质量”干扰，并借助微RNA介导的抗p50适体内伴侣作用，选择性阻断了难以成药的核因子κB通路。这项工作凸显了嵌合微RNA簇作为癌症及其他类似多因素疾病新兴治疗概念的潜力。
癌症，尤其是胶质母细胞瘤（GBM），如同一个拥有多重防御系统的顽固堡垒，单一靶向治疗往往收效甚微，这使其成为最致命的脑癌之一。RNA药物虽然前景广阔，但其在对付这类具有多重、冗余异常通路的复杂疾病时，常常显得力不从心。微RNA是细胞内调控基因表达的关键小分子，但单个微RNA的调控力量有限，且传统方法难以同时精准地上调抑癌基因和抑制促癌基因。有没有一种方法，能将多个不同的RNA工具“打包”递送，实现协同作战，从而攻克复杂疾病的堡垒呢？
一项发表于《SCIENCE ADVANCES》的研究，从一个意想不到的“副产品”中获得了灵感，开发出了一套极具潜力的多功能RNA基因治疗平台。研究人员意外地发现，在利用工程化的三微RNA簇（CL3）进行基因治疗时，除了产生预期的三个成熟微RNA（miR-124, miR-128, miR-137）外，其初始转录本（pri-miR）在被微处理器复合体（Drosha/DGCR8）切割后，两侧翼（5‘ 和 3’ flank）序列并未立即降解，而是作为稳定存在的“附属副产物”被释放出来。这一发现挑战了传统认知，即只有包含约70个核苷酸的茎环结构（pre-miR）才是微RNA加工的唯一相关产物。研究人员意识到，这些稳定的侧翼序列，就像火箭发射后遗留的助推器模块，或许可以被重新设计并赋予新的功能，从而极大地扩展微RNA基因的治疗潜力。
基于此，研究团队设计了一套“切割激活”策略。他们将微RNA簇的侧翼序列替换为能够“海绵”吸附并抑制特定促癌微RNA（如miR-21和miR-210）的Tough Decoy（TuD，一种双链RNA结构）。实验证明，这种改造后的嵌合体（如CL3_a1和CL3_a2）在细胞中仍能被正确加工，既过表达了原有的抑癌微RNA，又释放出能有效抑制目标促癌微RNA的TuD片段，实现了对五个关键失调微RNA的同时双向调控。在胶质母细胞瘤干细胞样细胞中，这种组合干扰显著抑制了细胞生长、迁移，并削弱了其在缺氧环境下的生存能力。
更有创意的是，研究人员进一步挖掘了微RNA茎环结构的潜力。他们设想，只要保持茎环结构能被Drosha识别和切割，其环状区域（loop）也可以被替换。于是，他们将一个约50个核苷酸的抗p50（NF-κB的一个亚基）RNA适体（aptamer）嵌入了miR-7的茎环中，创造出了“微RNA驱动的抗p50适体”（Mi-dAp50）。当这个嵌合单元整合到CL3_a2平台中，形成CL3_Ap50时，它不仅能实现前述的五微RNA调控，还能在微处理器切割后释放出具有生物活性的抗p50适体，从而在细胞内特异性阻断核因子κB（NF-κB）信号通路。
在动物模型中，这种多功能平台的威力得到了充分展现。与仅过表达三个微RNA的CL3相比，同时抑制miR-21和miR-210的CL3_a2几乎完全阻止了小鼠颅内胶质母细胞瘤的生长，所有接受治疗的小鼠在观察期结束时均未发现肿瘤。此外，携带Mi-dAp50的CL3_Ap50平台，通过与溶瘤单纯疱疹病毒1型（oHSV-1）联用，通过抑制肿瘤细胞内的NF-κB通路，显著增强了病毒的复制和扩散，从而大幅提升了溶瘤病毒疗法的抗肿瘤效果，将小鼠的中位生存期进一步延长了近三倍。
本研究综合运用了多种关键实验技术：对患者来源的胶质母细胞瘤干细胞样细胞（GSCs）和常规细胞系进行功能验证；利用短链非编码RNA测序（<200 nt）发现微RNA加工的副产物；通过Northern印迹、RT-qPCR（反转录定量聚合酶链反应）和PCR验证RNA的表达与加工；使用荧光素酶报告基因系统评估微RNA海绵（TuD）和NF-κB通路抑制的效果；通过蛋白质印迹（Western blot）、染色质免疫沉淀（ChIP）和RNA免疫沉淀（RIP）分析下游靶点和分子机制；利用克隆形成、伤口愈合、Transwell迁移和流式细胞术等体外实验评估细胞表型；最后，在免疫缺陷小鼠颅内原位移植瘤模型中评估治疗平台的体内疗效和生存获益，并探索了其与溶瘤病毒疗法的协同作用。
研究结果系统地验证了这一平台的可行性与高效性：
- 1.
微RNA加工释放附属的、稳定存在的小非编码RNA序列：研究人员通过RNA测序和Northern印迹等实验，首次证实了在微RNA转基因加工后，其侧翼序列作为稳定副产物持续存在，且其稳定性可通过工程化设计（如引入TuD结构）来增强。
- 2.
侧翼序列的重定向以扩展微RNA基因的生物学影响：通过将侧翼序列替换为针对致癌miR-21和miR-210的TuD，成功构建了能够同时上调和下调多个微RNA的嵌合体（CL3_a1, CL3_a2）。这些构建体在细胞中正确加工，并有效抑制了目标微RNA的活性，导致了预期的细胞表型改变，如抑制生长、迁移和缺氧存活。
- 3.
组合微RNA干扰的转化相关性：颅内动物实验证明，与单靶点调控或仅过表达抑癌微RNA相比，双向调控多个微RNA（CL3_a2）产生了显著的协同抗肿瘤效应，能够诱导肿瘤消退并大幅延长小鼠生存期，甚至达到无肿瘤状态。
- 4.
微RNA基因的茎环区域适用于进一步重定向：成功将抗p50 RNA适体嵌入miR-7的茎环中，创造了Mi-dAp50。该嵌合体能被正确加工并释放出功能完整的适体，在细胞内有效结合并抑制p50，从而阻断NF-κB信号通路。
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扩展RNA适体的适用性：将携带Mi-dAp50的平台（CL3_Ap50）与溶瘤病毒（oHSV-1）联用。由于Mi-dAp50抑制了肿瘤细胞内的NF-κB（病毒防御通路），显著增强了溶瘤病毒在肿瘤中的复制、传播和杀伤效果，在体内外均实现了强大的协同治疗作用。
结论与讨论部分强调，这项工作首次揭示了微RNA加工后产生的稳定“垃圾”副产物，并巧妙地将其转化为一种功能强大的模块化基因治疗平台。该平台的核心优势在于其“即插即用”的灵活性：只需保留Drosha切割位点，就能在同一个RNA聚合酶II驱动的转录本中，整合多种功能各异的小非编码RNA（如治疗性微RNA、抑制性TuD、功能性适体），实现前所未有的多靶点、多机制协同干预。这不仅为胶质母细胞瘤等复杂癌症提供了新的治疗思路，其原理也有望推广至其他涉及多通路异常的疾病，如心血管和神经退行性疾病。同时，研究提出的“微RNA驱动适体”（Mi-dA）概念，突破了细胞内表达RNA适体对RNA聚合酶III的依赖，为靶向传统难以成药的靶点（如转录因子）开辟了新途径。尽管平台的承载上限、最佳组合以及递送策略仍需进一步探索，但这项研究无疑重新定义了微RNA基因的治疗潜力，为下一代RNA药物设计提供了一个极具前景的通用型框架。
