《SCIENCE ADVANCES》：Munc13-1 couples DAG and Ca2+ signaling to dynamic vesicle priming, synaptic short-term plasticity, and posttetanic potentiation
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本研究聚焦于突触前关键蛋白Munc13-1如何整合第二信使二酰甘油（DAG）和钙离子（Ca2+）信号，动态调控突触囊泡（SV）的预装配（priming）过程。研究人员通过构建脑干特异性表达DAG结合缺陷型Munc13-1变体（H567K）的杂合子小鼠模型，结合电生理学、超分辨成像与动力学建模技术，在听觉中枢的Held萼突触上进行原位研究。结果揭示，Munc13-1的C1和C2B结构域依赖的调控决定了基础突触强度，并精细塑造了短时程可塑性（STP）及强直后增强（PTP）。该研究首次在完整神经环路中明确了Munc13-1是突触前TrkB–PLC-γ信号通路的下游效应器，为解决DAG-Munc13信号在体内的功能及其在活动依赖性突触调节中的核心作用这一长期悬而未决的问题提供了关键证据。
想象一下大脑中数以万亿计的神经连接点——突触，它们如同精密的信息中继站，其传递信号的效率并非一成不变，而是会根据过往的活动经历动态调整。这种被称为“突触可塑性”的能力，是学习和记忆的神经基础。在突触前末梢，神经递质的释放依赖于突触囊泡（SV）与细胞膜的融合。而囊泡在释放前，必须经历一个称为“预装配（priming）”的准备过程，使其处于随时可以快速融合的待命状态。Munc13蛋白家族，尤其是Munc13-1，是执行这一关键步骤的核心分子。已知突触前第二信使二酰甘油（DAG）和钙离子（Ca2+）信号可以调控突触传递，并汇聚于Munc13-1的调控结构域，但其在完整神经系统中的具体作用机制、尤其是如何影响突触的动态行为（如短时程可塑性），仍然模糊不清。为了揭开这些谜团，一项发表于《SCIENCE ADVANCES》的研究应运而生。
本研究主要采用了以下关键技术方法：1) 遗传小鼠模型构建：利用条件性基因敲除和点突变敲入技术，结合脑干特异性表达的Krox20Cre工具鼠，构建了仅表达单个野生型（wt/?）或单个DAG结合缺陷型Munc13-1 H567K突变体（HK/?）等位基因的杂合子小鼠模型，从而在Held萼突触上进行原位功能比较。2) 电生理学记录：在听觉中枢的斜方体内侧核（MNTB）神经元上，记录动作电位诱发的兴奋性突触后电流（eEPSC）、微小兴奋性突触后电流（mEPSC）以及突触前钙电流（ICa(V)）和电容变化（ΔCm），以全面评估突触传递强度、短时程可塑性和囊泡释放动力学。3) 超分辨率显微成像：使用随机光学重建显微术（STORM）对脑干切片进行免疫标记，定量分析突触前活性区（AZ）内Munc13-1的纳米级簇集数量、大小及空间分布。4) 计算建模：基于序贯两步囊泡预装配模型，对实验获得的突触反应数据进行动力学模拟和非负张量分解（NTF），以量化不同预装配状态囊泡池的大小和转化速率。
研究结果
Munc13-1 C1结构域H567K突变在不改变突触前钙内流的情况下增强谷氨酸释放。
研究发现，与wt/?突触相比，HK/?突触的单次动作电位诱发的eEPSC幅度显著增大，但其动力学和突触前电压门控钙通道功能（ICa(V)幅度）以及钙内流-胞吐耦合效率均未改变。这表明突触强度的增加并非源于钙信号增强，而是与囊泡释放过程本身有关。
H567K突变严重损害了由佛波酯（PDBu）和TrkB受体激动剂诱导的谷氨酸释放增强。
外源应用DAG类似物PDBu或内源激活TrkB-PLC-γ通路（使用激动剂7,8-DHF），在wt/?突触中能显著增强eEPSC幅度和mEPSC频率，但在HK/?突触中这种增强效应被大幅削弱。这直接证明了Munc13-1是突触前TrkB-PLC-γ-DAG信号通路的关键下游效应器。
HK/?突触中Munc13-1在活性区的丰度和纳米尺度组织未受扰动。
通过STORM超分辨成像和免疫荧光定量分析，发现wt/?和HK/?突触的活性区中，Munc13-1的相对蛋白量、纳米簇数量（每个活性区约7个）和大小以及与支架蛋白Bassoon的空间关系均无差异。这排除了突变导致Munc13-1定位或聚集异常的可能性，提示功能变化源于蛋白质活性的改变。
更高的完全预装配囊泡丰度是HK/?突触释放增强的主要原因。
通过记录不同频率的刺激序列并利用NTF分解分析，研究人员将快速释放囊泡池（FRP）进一步区分为松散停靠（LS）和紧密停靠（TS）两种预装配状态。分析表明，HK/?突触中已完全预装配、具备融合能力的TS囊泡比例（fTS）显著高于wt/?突触，而TS囊泡本身的融合概率（pfusion）仅有轻微增加。因此，突触强度的提升主要归因于静息状态下LS到TS的预装配平衡向TS状态倾斜。
HK/?突触缺失高频刺激后突触反应恢复的快速成分，且强直后增强（PTP）严重减弱。
在200赫兹高频刺激后，wt/?突触的eEPSC恢复呈现双相性，存在一个快速的恢复成分，而HK/?突触则完全缺失这一快速恢复，仅保留慢速恢复。这提示Munc13-1 C1结构域对于活动依赖性的囊泡池再填充加速至关重要。同样，在诱发PTP的强直高频刺激（THFS）后，HK/?突触的eEPSC增强幅度仅为wt/?突触的一小部分，表明Munc13-1依赖性囊泡预装配是PTP产生的关键机制。
Munc13-1 C2B结构域的突变双向调节PTP。
为了探究Ca2+信号的作用，研究检测了另外两种Munc13-1 C2B结构域突变小鼠。其中，Ca2+-磷脂结合减弱的DN/DN突变体表现出减弱的PTP，而Ca2+-磷脂结合增强的KW/KW突变体则表现出增强的PTP。这进一步证实了Munc13-1通过其C2B结构域感知Ca2+信号，从而调控PTP的幅度。特别值得注意的是，同时携带HK和DN突变的转杂合子（HK/DN）小鼠，其PTP受损程度与HK/?小鼠类似，提示C1和C2B结构域的功能存在分子内的相互依赖。
一个序贯两步囊泡预装配模型能够复现wt/?和HK/?突触的短时程可塑性。
基于囊泡从空位点（ES）到LS再到TS的序贯预装配模型，通过调整关键速率常数（如静息时LS到TS的转化速率k2,rest，以及对Ca2+的敏感性参数σ1和σ2），成功地模拟出了HK/?突触所表现出的初始强度高、高频稳态释放低以及恢复慢等特征。模型支持HK突变导致静息时预装配平衡改变，并损害了活动期囊泡补充的Ca2+依赖性加速。
结论与讨论
本研究的核心结论是：Munc13-1作为突触前DAG和Ca2+信号的关键整合器，通过其C1和C2B结构域的协同作用，动态调控囊泡的预装配状态，从而精密设定基础突触强度并塑造多种形式的短时程可塑性。具体而言，在静息状态下，C1结构域对Munc13-1的活性有一定自抑制作用；H567K突变或DAG结合可能解除这种抑制，使更多囊泡处于完全预装配的TS状态，从而提升基础释放概率。在活动期间，尤其是高频刺激引起突触前全局钙浓度升高后，Ca2+通过C2B结构域（可能也与C1结构域相互作用）加速囊泡池的再填充，以维持持续传递并产生PTP。HK突变不仅废除了DAG信号传导，还可能破坏了C1-C2B结构域间的功能耦合，导致其无法有效响应活动引起的钙信号，因此表现为稳态释放降低、恢复减慢和PTP减弱。
这项研究的意义重大。它首次在完整的神经环路中明确揭示了内源性DAG信号（通过TrkB-PLC-γ通路）经由Munc13-1调控突触功能的生理路径。研究澄清了关于DAG/佛波酯增强释放机制的争议，通过精细的动力学分析证明其主要作用于囊泡预装配阶段，而非单纯提高囊泡融合概率。此外，研究确立了Munc13-1依赖性囊泡预装配动态调节是PTP的核心细胞机制，为理解短时程记忆等神经计算功能提供了分子基础。这些发现将Munc13-1置于突触前可塑性调控的中心位置，为研究与突触功能障碍相关的神经系统疾病提供了新的靶点和思路。
