《SCIENCE ADVANCES》：De novo identification of the specificities of recurrently identified human T cell receptors
编辑推荐：
本文推荐一篇开创性的研究，研究者开发了一套名为AIMcap的全新工作流程。该流程能高效地从零开始（de novo）确定在人群中反复出现的“公共”T细胞受体（TCR）所识别的病毒抗原特异性。通过功能筛选与邻近标记（Proximity Labeling, PL）技术，研究成功揭示了多种常见病毒（如季节性冠状病毒、流感B型、疱疹病毒等）中先前未知的免疫优势表位，为大规模解析人群免疫记忆、开发基于T细胞的诊断与治疗策略提供了强大工具。
引言
过往的病毒暴露记忆，以T细胞受体（TCR）基因重排的形式储存在T细胞的DNA中。在不同个体的T细胞中反复发现的TCR序列被称为“公共”TCR，它们是特定病毒暴露的生物标志物。然而，大多数公共TCR序列的特异性是未知的，现有数据库主要集中于巨细胞病毒（CMV）、EB病毒（EBV）、流感A型（Flu A）和SARS-CoV-2等少数病毒的表位。为了更全面地理解人群水平的免疫历史、解释T细胞测序数据以及开发血液诊断和抗病毒疗法，迫切需要建立一种能够从头鉴定大量公共TCR抗原特异性的高效方法。传统表位鉴定方法（如四聚体、ELISPOT）以及近年来发展的高通量技术，在测试大量TCR时仍存在扩展性限制。本研究旨在开发一个工作流程，以从头鉴定公共TCR的靶向特异性。
结果
公共TCR的选择与病毒抗原反应性筛选系统的建立
研究团队从健康个体（样本收集于新冠疫情前）的外周血克隆性扩增T细胞中，评估了一组TCRβ序列。这些序列满足以下条件：在健康个体中反复发现，可在单细胞TCR测序数据集中找到配对的TCRα基因，并且在具有相同人类白细胞抗原（HLA）I类等位基因的个体中反复出现（提示其为抗原识别驱动，而非V(D)J重组概率增加）。其中一部分T细胞已被证实对CMV、EBV或Flu A具有特异性，但其他TCR的靶向特异性未知。研究假设这些未知TCR也可能识别常见的病毒抗原。为了鉴定其表位，研究者开发了一个能够从数千个候选肽中高效鉴定同源表位的工作流程。
该工作流程的第一阶段是病毒抗原反应性初筛。首先，将编码潜在抗原（如覆盖整个病毒基因组的重叠50个氨基酸肽段）的寡核苷酸克隆到慢病毒载体中，并转导到与患者HLA相容的“人工”抗原呈递细胞（aAPC）中。将这些包含aAPC库的细胞铺在96孔板中，每个孔约有7500个aAPC。同时，将候选公共TCR对克隆到TCR敲除（KO）的Jurkat T细胞中。这些Jurkat细胞经过工程化改造，表达了表面锚定的高亲和力抗白细胞介素-2（IL-2）抗体，能够捕获自身分泌的IL-2，从而实现对T细胞活化的双报告检测：通过流式细胞术同时检测表面CD69（一种活化诱导标记，AIM）的表达和被捕获的IL-2。这种双报告系统显著提高了检测的特异性。研究证实，该系统能够在一个96孔板的一个孔中，特异性地检测出TCR对高度复杂的病毒抗原库（如包含4867个编码肽段的CMV全基因组文库）的反应性。
利用邻近标记技术建立T细胞表位分选与鉴定系统
工作流程的第二阶段旨在精确鉴定在第一阶段筛选中呈阳性反应的TCR所识别的特定肽段。研究者开发了一种基于邻近标记（PL）的T细胞抗原鉴定技术。其原理是：在TCR表达的Jurkat细胞与aAPC库共培养后，使用与辣根过氧化物酶（HRP）连接的抗体（如抗CD69或抗IL-2抗体）标记活化的Jurkat细胞。加入生物素-酪酰胺底物后，HRP催化反应会在活化的Jurkat细胞表面及其邻近的aAPC界面共价沉积生物素分子，从而实现信号从T细胞到呈递特异性抗原的aAPC的传递。随后，可以通过磁激活细胞分选（MACS）或流式分选来富集被生物素标记的aAPC，再通过下一代测序（NGS）分析这些aAPC中整合的肽段编码DNA，从而鉴定出被TCR识别的免疫原性肽段。
作为原理验证，研究使用已知靶点的CMV特异性TCR（CMV-TCR #1和#2）以及包含32个常见CMV、EBV、流感（CEF）肽段的文库进行了测试。结果表明，使用抗CD69或抗IL-2介导的PL，能够成功地从混合文库中富集并鉴定出目标表位（如CMV-TCR #1的表位TPRVTGGGAM），而使用非活化依赖的抗CD2介导的PL则无法有效富集。进一步地，使用包含4867个肽段的CMV全基因组文库，该系统也成功鉴定出了CMV-TCR #2的表位YSEHPTFTSQY。这些结果证明了该 assay 能够从包含数十至数千个编码肽段的混合库中，通过CD69或表面结合IL-2介导的PL来鉴定T细胞靶向的同源表位。
对假定抗原库进行T细胞反应性的系统测试
为了筛选抗原反应性，研究者构建并合成了覆盖CMV（4867个肽段）、EBV（3517个肽段）以及流感A/B（1266个肽段）所有注释基因的重叠肽段文库。将这些文库转导至表达相应HLA等位基因的aAPC中。同时，将一组公共TCR（包括已知和未知特异性的）克隆到工程化Jurkat细胞中。通过共培养和流式分析，研究成功验证了多个已知特异性的TCR（如靶向EBV表位CLGGLLTMV的TCR #1，以及靶向CMV表位VTEHDTLLY的TCR #2.1/#2.2等），并发现了一些TCR对特定病毒文库有反应（如TCR #4对CMV库有反应，TCR #5对EBV库有反应，TCR #6对Flu库有反应），而TCR #7.1、#7.2、#8和#9则对CMV、EBV或Flu文库无明显反应。
筛选人类参考病毒文库
为了鉴定TCR #7.1、#7.2、#8和#9的靶抗原，研究将搜索范围扩展至更多病毒基因组。他们合成了覆盖949种已知感染人类的参考病毒株所有注释基因的82，197个重叠肽段编码寡核苷酸。为了在高复杂度文库中提高检测灵敏度，将整个文库划分为96个亚库（每个约含857个肽段）。将这些亚库转导到HLA相容的aAPC中并铺在96孔板内，然后将每个Jurkat细胞克隆与每个亚库孔共培养进行筛选。结果表明，对于之前对CMV/EBV/Flu无反应的TCR #7.1、#7.2、#8和#9，每个TCR都有一到多个亚库能够激活Jurkat细胞，提示它们确实是抗病毒TCR，但靶向CMV、EBV和Flu之外的病毒表位。
通过邻近标记确定公共TCR的靶向病毒
利用PL技术，研究者从阳性反应的单个病毒文库或多病毒筛选中最具反应性的亚库开始，分选免疫原性肽段。对分选出的aAPC进行NGS分析后，成功鉴定了多个先前未知特异性的公共TCR的靶向病毒表位：
- •
TCR #7.1 和 #7.2：识别季节性冠状病毒HCoV-OC43 RNA依赖性RNA聚合酶（NSP12）衍生的肽段（对应50-mer称为RIL 50-mer）。该TCRβ序列在队列（美国健康供体）中14.4%的个体外周血中发现，与人群中极高的HCoV-OC43暴露率一致。
- •
TCR #8：识别单纯疱疹病毒1型（HSV-1）α整合蛋白（VP16）衍生的肽段（DFD 50-mer）。该TCRβ序列在5.0%的个体中发现。
- •
TCR #9：识别HSV-1 VP11/12衍生的肽段（VST 50-mer）。该TCRβ序列在5.0%的个体中发现。
- •
TCR #6：识别流感B型（Flu B）血凝素（HA）衍生的肽段（AAS 50-mer）。该TCRβ序列在5.1%的个体中发现。
- •
TCR #4：识别巨细胞病毒（CMV）UL44衍生的肽段（FYQ 50-mer）。该TCRβ序列在5.3%的个体中发现。
确定完整的TCR-肽段-HLA复合物
在鉴定出包含目标表位的50个氨基酸肽段后，研究者使用NetMHCpan-4.1预测了其中最小化的HLA结合肽，并通过功能实验进行了验证，最终确定了完整的TCR-肽段-HLA复合物：
- •
TCR #7.1/#7.2：HLA-A*01:01限制性，表位为AIDAYPLVY（源自HCoV-OC43 NSP12）。
- •
TCR #8：HLA-A*01:01限制性，表位为FTDALGIDEY（源自HSV-1 VP16）。
- •
TCR #9：HLA-A*02:01限制性，表位为ATDSLNNEY（源自HSV-1 VP11/12）。
- •
TCR #6：HLA-A*02:01限制性，表位为GLDNHTILL（源自Flu B HA）。
- •
TCR #4：HLA-A*01:01限制性，表位为VTEHDTLLY（源自CMV UL44）。
此外，在少量健康供体的外周血CD8+T细胞中，研究者检测到了针对其中一些表位（如AIDAYPLVY、FTDALGIDEY、GLDNHTILL、VTEHDTLLY）的免疫反应，证实了这些表位是人群中常见的CD8+T细胞靶点。
确定病毒间和毒株间的交叉反应性
研究进一步探索了所鉴定TCR对相关病毒和毒株的交叉反应性：
- •
TCR #7.1（抗HCoV-OC43）：对其它季节性冠状病毒（HCoV-NL63/HCoV-229E）以及大流行冠状病毒（SARS-CoV-2）的对应肽段表现出交叉反应性，尽管活化程度较HCoV-OC43本尊表位有所降低。这提示该公共TCR可能对后出现的大流行冠状病毒存在预存免疫贡献。
- •
TCR #8（抗HSV-1）：对HSV-2的对应肽段（FTDAMGIDDF）无交叉反应，表现为HSV-1特异性。
- •
TCR #9（抗HSV-1）：对HSV-2的对应肽段（ASDSLNNEY）具有交叉反应性。
- •
TCR #6（抗Flu B）：其靶向的表位GLDNHTILL在测试的所有Flu B毒株中完全保守，位于HA蛋白连接区和跨膜结构域的连接处，可能因其不易受抗体介导的进化压力而成为人群中常见的Flu B表位。
讨论
本研究描述的AIMcap工作流程能够从头破译公共TCR的反应性。该流程的核心优势在于：首先，利用工程化的双报告Jurkat细胞，可快速在96孔板规模上测试TCR对完整病毒基因组或近千个病毒基因组（通过82，197个重叠肽段）的反应性；其次，通过基于活化诱导标记（AIM）或细胞因子的邻近标记技术，能够精准定位TCR的靶表位。利用此流程，研究成功鉴定了在健康人群中常见、但先前为“孤儿”状态（特异性未知）的多个公共TCR的特异性，例如针对季节性冠状病毒、HSV-1和Flu B的TCR，这些发现极大地拓宽了现有公共TCR特异性数据库。
该技术可与高通量TCR克隆方法结合，用于大规模筛选。T细胞PL是首个从T细胞活化内源性信号（如细胞因子捕获或AIM）启动的抗原鉴定技术，具有高特异性，且无需对aAPC或T细胞进行额外的遗传改造，未来易于改造用于研究CD4+T细胞特异性或非病毒抗原（如细菌、自身免疫、肿瘤、过敏原肽段）。
对公共TCR特异性的更完整认知，有助于通过深度TCR测序高灵敏度、高特异性地诊断个体过去的病原暴露史，并可能揭示病毒感染与某些急慢性疾病（如流感与吉兰-巴雷综合征、EBV与多发性硬化症）之间的关联。此外，鉴定出的公共TCR及其表位（如高度保守的Flu B表位）可为疫苗设计和TCR细胞疗法开发提供有价值的资源。总之，这项研究为高效解析TCR-肽段-HLA复合物、绘制人群共享免疫记忆图谱提供了强大的新工具。
