《SCIENCE ADVANCES》：Structural basis for domain coupling in heteromeric glycine receptors revealed by an atypical allosteric agonist
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本刊推荐：为揭示五聚体配体门控离子通道（pLGICs）的变构调控机制，研究者聚焦异源甘氨酸受体（GlyRα1β），利用伊维菌素（ivermectin）和士的宁（strychnine）这一对作用相反的配体，通过冷冻电镜（cryo-EM）捕获了受体在多种配体浓度下的中间态结构，并结合电生理与分子动力学（MD）模拟，阐明了从跨膜域（TMD）到胞外域（ECD）的“自下而上”变构激活新通路，为理解pLGICs的门控机制及药物设计提供了新见解。
在大脑和脊髓中，信息的快速传递离不开一类名为五聚体配体门控离子通道（pentameric ligand-gated ion channels, pLGICs）的蛋白质“守门员”。它们像微型感应开关，当接收到特定的化学信号（配体）时，就会打开通道，允许离子流入或流出细胞，从而产生或抑制神经电信号。甘氨酸受体（Glycine receptors, GlyRs）就是其中重要的一员，它主要负责抑制性的信号传递，对运动控制等功能至关重要。如果它的工作出了问题，就可能导致严重的运动障碍，例如过度惊跳症（hyperekplexia）。
科学家们已经知道，pLGICs就像是一个精密的分子机器，主要包含三个部分：伸出细胞外的“天线”（胞外域，Extracellular Domain, ECD）、镶嵌在细胞膜中的“门户”（跨膜域，Transmembrane Domain, TMD）和伸入细胞内的“尾巴”（胞内域，Intracellular Domain, ICD）。传统的观点认为，信号传递是一个“自上而下”的波：激动剂分子（如甘氨酸）结合在ECD的特定位置（正构位点），引发ECD的构象变化，这个变化像波浪一样传递到TMD，最终导致离子通道的开放。然而，自然界中存在许多“变构调节剂”，它们并不直接占据正构位点，而是结合在受体的其他部位（如TMD），却能同样影响通道的开闭。这暗示着信号的传递可能也存在“自下而上”的路径。那么，这两种路径引发的受体构象变化是相同的吗？它们如何协同工作？要回答这些问题，就需要捕捉受体在功能转换过程中的“中间快照”，但这在技术上极具挑战性。
近日，一篇发表在《SCIENCE ADVANCES》上的研究，巧妙地利用一对作用相反的“分子扳手”，为我们揭开了甘氨酸受体变构激活的神秘面纱。研究人员选择了一个经典的竞争性拮抗剂——士的宁（strychnine），它能牢牢地占据ECD的正构位点，将受体“锁”在关闭状态；同时，他们选用了一个非典型的变构激动剂——伊维菌素（ivermectin），它能结合在TMD的一个变构位点上。有趣的是，即使士的宁在场，高浓度的伊维菌素依然能强行“撬动”通道，产生电流。这就好比一个门被两把锁从不同方向控制着，研究者想看看，当用一把钥匙（伊维菌素）从内部（膜内）开锁时，门的结构（受体构象）会如何变化，以及这把内部钥匙又如何影响另一把外部锁（士的宁）的状态。
为了阐明这一机制，研究者综合运用了多种技术。他们首先通过非洲爪蟾卵母细胞双电极电压钳（Two-electrode voltage-clamp, TEVC）电生理实验，验证并量化了伊维菌素在饱和浓度士的宁存在下的激活能力。随后，利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统纯化了斑马鱼来源的异源甘氨酸受体α1β亚基与gephyrin蛋白E结构域的复合物（GlyRα1β），为结构研究提供了材料。研究的核心是冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）技术，他们在固定浓度士的宁（200 μM）和四种递增浓度伊维菌素（0.2, 0.5, 2, 20 μM）的条件下，分别解析了受体复合物的高分辨率结构。最后，为了探究配体结合的动态特性，他们对关键结构进行了分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟，分析了士的宁在变构效应下的稳定性。
研究结果部分通过一系列结构比较，揭示了激动与拮抗的“分子博弈”：
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“功能性验证与结构确定”：电生理实验证实，低浓度伊维菌素（0.2, 0.5 μM）无法产生有效电流，而高浓度（2, 20 μM）则能激活通道。冷冻电镜获得了四种条件下分辨率均优于2.9 ?的结构，分别命名为GlyRα1β-XIvm200Stry（X代表伊维菌素浓度）。
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“整体构象与通道孔特征”：结构分析显示，受体状态呈现明显的“二分法”。在0.2和0.5 μM伊维菌素条件下（无伊维菌素密度），其跨膜域（TMD）的通道孔与单独使用士的宁的关闭状态几乎一致，存在Leu9′和Pro/Ala?2′两个位点的缩窄，阻碍离子通透。而在2和20 μM伊维菌素条件下（五个界面均观察到伊维菌素密度），TMD的通道孔则转变为类似完全脱敏态（desensitized state）的构象：Leu9′位点开放，但Pro/Ala?2′“脱敏门”依然关闭。这表明伊维菌素引发了TMD向脱敏态的协同、近乎对称的转变。
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“伊维菌素结合位点”：伊维菌素结合在TMD的亚基界面处，主要与初级亚基的M3螺旋和互补亚基的M1螺旋发生疏水相互作用。在异源界面（α1/β和β/α1），由于β亚基特异的异亮氨酸（β Ile333）等残基的影响，伊维菌素的结合密度较弱，提示其结合亲和力可能较低，并可能影响其占据率。
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“士的宁结合”：在低伊维菌素浓度及2 μM条件下，士的宁以典型的垂直方向稳定结合在正构位点。然而，在20 μM伊维菌素条件下，士的宁的密度变得弥散，提示其结合可能不稳定或存在替代构象。分子动力学模拟进一步证实，随着起始模型中伊维菌素浓度的增加，模拟过程中士的宁的结合稳定性显著下降，其结合口袋体积扩大，位于结合口袋关键位置的Loop C等区域灵活性增强，这支持了伊维菌素通过变构效应影响正构位点稳定性的观点。
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“亚基结构域的变构重排”：这是本研究最核心的发现。通过详细比较不同结构，研究人员发现，随着伊维菌素浓度增加，TMD表现出一种“非全即无”的、协同且近乎对称的转变，从关闭态直接跳变到脱敏态。相反，ECD的响应则是“渐进式”和分级的：靠近TMD的ECD/TMD偶联区域（如M2-M3环、β1-β2环、Cys环等）随着伊维菌素浓度增加逐渐向脱敏态构象移动，而远离膜的正构位点附近区域（如Loop B、Loop C）则受士的宁的拮抗作用限制，变化相对较小。这种模式清晰地描绘出一条“自下而上”的变构信号通路：伊维菌素在TMD的结合首先引发TMD的协同转变，这个信号再逐步向上传递至ECD，但ECD的不同区域响应程度不同，形成了空间异质性的构象中间态。
在结论与讨论部分，该研究强调其工作阐明了甘氨酸受体的一种变构激活机制，并探索了正构与变构位点之间的相互作用。研究表明，伊维菌素这一变构激动剂，能够通过与甘氨酸等正构激动剂相同的结构变化路径来激活受体，但信号传递方向相反——起源于TMD并向上传播至ECD。研究捕获的中间态结构虽然代表平衡态，但揭示了不同结构域在激活途径中的能量变化顺序。特别指出，TMD的协同对称转变支持了通道孔开放需要五个亚基M2螺旋集体行动的观点，而ECD的渐进式、可能不对称的响应则与正构激动剂引发的“自上而下”信号传导初期步骤相呼应。本研究的策略——使用相互拮抗的配体来探测变构激活——不仅增进了对甘氨酸受体本身的理解，也拓展了对整个pLGIC家族在功能转换过程中可利用构象景观的普遍认知，这将有助于未来开发针对该蛋白家族更有效的药理调控工具。
