从一名下肢骨折患者的尿液样本中分离出一株耐碳青霉烯类大肠杆菌（ST58/ST87）：blaNDM-5基因位于IncHI2/IncHI2A质粒并与IncF多重耐药质粒共存

《Infection and Drug Resistance》：Coexistence of a blaNDM-5-Harboring IncHI2 Plasmid and an IncF Multidrug-Resistance Plasmid in a Clinical Escherichia coli Strain from Urine Sample of a Patient with Lower Limb Fracture

本文全面解析了一株从患者尿液样本中分离的耐碳青霉烯类大肠杆菌EC6622（ST58/ST87）的完整基因组，重点揭示了其携带的两个关键耐药质粒：一个携带有碳青霉烯酶基因blaNDM-5的IncHI2/IncHI2A型质粒pEC6622-1，以及一个携带多重耐药基因簇的IncFIBAP001918/IncFII型质粒pEC6622-2。研究深入分析了blaNDM-5所处的复合转座子Tn3000的遗传环境，以及两种质粒上共存的3个I类整合子，为理解该类耐药菌株的耐药机制（尤其是NDM-5的传播）和潜在的流行病学传播风险提供了详细的分子遗传学证据。

　　

菌株鉴定与药物敏感性

研究报道了一株从一名70岁女性下肢骨折患者的尿液样本中分离出的耐碳青霉烯类大肠杆菌EC6622。药物敏感性测试（AST）结果表明，该菌株对包括头孢菌素类（如头孢西丁、头孢曲松、头孢他啶等）、碳青霉烯类（亚胺培南、厄他培南）、喹诺酮类（左氧氟沙星）、磺胺甲恶唑/甲氧苄啶以及β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复合物（阿莫西林-克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦）在内的多种抗生素均表现出耐药性。

基因组基本特征

该菌株的全基因组测序揭示其包含一个4.76 Mb的染色体和两个质粒：一个262.41 kb的质粒pEC6622-1和一个140.10 kb的质粒pEC6622-2。多位点序列分型（MLST）显示其为ST58（Achman方案）或ST87（Pasteur方案），血清型为O155:H21。质粒复制子分析表明，pEC6622-1为IncHI2/IncHI2A杂交质粒，pEC6622-2为IncFIB_AP001918/IncFII杂交质粒。

抗生素耐药基因与毒力因子分布

耐药基因（ARGs）检测发现，染色体上未发现获得性耐药基因，但存在一个与喹诺酮类耐药相关的gyrA基因点突变（S83L）。染色体上还编码了一系列外排泵基因，涉及RND、MFS、ABC和SMR等多种系统，这些系统共同作用，导致菌株对氟喹诺酮类、大环内酯类、β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类及消毒剂等具有广泛的外排介导的耐药性。

两个质粒是耐药基因的主要载体。IncHI2/IncHI2A质粒pEC6622-1携带了丰富的耐药基因，包括碳青霉烯酶基因bla_NDM-5、其他β-内酰胺酶基因（如bla_OXA-10）、氨基糖苷类修饰酶基因、磺胺类（sul3）、氯霉素类（floR, cmlA1）、四环素类（tet(A)）、甲氧苄啶（dfrA14）、利福平（ARR-2）和喹诺酮类（qnrS1）耐药基因。IncF质粒pEC6622-2则携带了消毒剂耐药基因（qacE, sitABCD）、四环素耐药基因（tet(A)）、β-内酰胺酶基因（bla_TEM-1B）、磺胺类（sul1）、氨基糖苷类（aadA1）和甲氧苄啶（dfrA1）耐药基因。

毒力因子分析显示，菌株的毒力因子分布于染色体和pEC6622-2质粒上。染色体上的毒力因子与T2SS、T3SS效应物、卷曲菌毛、肠杆菌素、1型菌毛等有关。质粒pEC6622-2则携带了与沙门氏菌素铁载体相关的毒力因子。

IncHI2/IncHI2A质粒pEC6622-1的耐药区域与bla_NDM-5遗传环境

质粒pEC6622-1上的获得性耐药基因主要聚集在两个大的多重耐药（MDR）区域内。

第一个MDR区域（约41 kb）包含了碳青霉烯酶基因bla_NDM-5。该基因位于复合转座子Tn₃₀₀₀上，两端由方向相反的两个IS₃₀₀₀序列所包围。其具体的遗传环境为ΔIS_Kox3-IS₃₀₀₀-ΔIS_Aba125-IS₅-bla_NDM-5-ble_MBL-trpF-dsbC-ΔcutA-IS₂₆-ΔIS_Vsa5-IS₃₀₀₀-IS_1A。在此区域内还发现了一个复杂的I类整合子，包含整合酶基因intI1以及aadA2、cmlA1、aadA1、ΔqacL和sul3等基因盒。

第二个MDR区域（约18 kb）包含了另一个I类整合子，其两侧为两个直接重复的IS₂₆序列，该整合子含有intI1以及ARR-2、cmlA1、bla_OXA-10、aadA1和dfrA14等基因盒。此外，喹诺酮耐药基因qnrS1位于一个截短的Tn₆₃₉₆上。

IncF质粒pEC6622-2的耐药区域与传播性

质粒pEC6622-2上的获得性耐药基因集中于一个约23 kb的MDR区域内。该区域包含四环素耐药基因tet(A)–tetR(A)，一个含有mer操纵子（汞抗性）和β-内酰胺酶基因bla_TEM-1B的Tn₃样区域，以及一个I类整合子（包含intI1和dfrA1、aadA1、qacEΔ1、sul1基因盒）。通过数据库比对发现，该23 kb MDR区域与另外7个来自不同大肠杆菌菌株的IncF质粒中的对应区域高度相似（覆盖度100%，一致性≥99%），表明这一多重耐药模块可能在IncF质粒间具有较高的传播潜力。

讨论与意义

大肠杆菌ST58是一种新兴的全球性尿路病原体，常可导致败血症，在人类、动物和环境间传播，构成重要的“One Health”问题。本研究在ST58菌株中发现bla_NDM-5位于一个大型的IncHI2/IncHI2A质粒上。IncHI2质粒以其活跃获取外源耐药基因（如mcr-1）的能力而闻名，bla_NDM-5在该类型质粒上的出现增加了其传播风险。

研究中bla_NDM-5基因位于Tn₃₀₀₀转座子中，而Tn₃₀₀₀被认为在肠杆菌科中，特别是在印度次大陆，是介导bla_NDM传播的重要移动元件。这表明该菌株可能通过此类转座子获得了碳青霉烯酶耐药性。

此外，菌株共存的IncF多重耐药质粒携带了经典的耐药模块（如含有bla_TEM-1B的Tn₃样区域），并且该模块在多个质粒间高度保守，进一步凸显了耐药基因通过质粒水平转移在细菌群体中扩散的严重性。

研究在两种质粒上均发现了I类整合子，这类整合子是细菌获取和交换耐药基因盒的关键元件，在临床分离株中检出率高，与多重耐药菌的出现和传播密切相关。它们的存在为菌株累积和传播多种耐药基因提供了强大的遗传平台。

结论

本研究报告了一株从下肢骨折患者尿液中分离的耐碳青霉烯类大肠杆菌EC6622（ST58/ST87）的完整基因组。该菌株同时携带两个关键的耐药质粒：一个携带bla_NDM-5（位于Tn₃₀₀₀转座子中）的IncHI2/IncHI2A质粒，和一个携带保守多重耐药模块的IncFIB_AP001918/IncFII质粒。两种质粒上均存在I类整合子。这些发现详细阐述了该菌株复杂的耐药基因库和移动遗传元件背景，为了解碳青霉烯酶NDM-5的传播机制以及此类高危耐药菌株的流行病学提供了重要的分子遗传学依据。