《Infection and Drug Resistance》：A Nomogram Predictive Model for Drug-Resistant Tuberculosis Detection by GeneXpert MTB/RIF Assay in Paediatric Patients
引言
结核病（TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）引起的全球重大公共卫生威胁。据世界卫生组织（WHO）《2023年全球结核病报告》，2022年全球约有1060万新发结核病例，其中12%发生在儿童和青少年中。耐药性结核病（DR-TB）的流行，特别是多药耐药结核病（MDR-TB）和利福平耐药结核病（RR-TB），使得疾病控制更加复杂。儿童DR-TB的诊断面临临床表现不典型、菌载量低及标本采集困难等挑战，导致诊断延迟和治疗失败。因此，亟需开发基于临床和影像学特征的早期预警工具来弥补微生物学检测的不足。
大多数关于DR-TB的预测研究集中在成人群体。然而，儿童及青少年在流行病学特征、耐药机制和免疫反应方面与成人存在显著差异。现有预测模型多基于单一维度的临床或影像数据，且人群异质性限制了其推广性。开发一个专门针对儿童患者、整合多种模态（临床与影像）的特异性预测模型，对于优化早期筛查策略至关重要。
T淋巴细胞介导的细胞免疫在清除MTB中发挥着核心作用。然而，细胞免疫功能失调与DR-TB之间的关系仍存在争议。一些研究显示DR-TB患者的CD4+和CD8+T细胞计数显著高于药物敏感结核病（DS-TB）患者，而另一些研究则得出相反结论。这些相互矛盾的发现可能源于研究人群、年龄或耐药机制复杂性的差异，凸显了对儿童群体进行独立研究的必要性。
对于儿童DR-TB的治疗，准确诊断是有效治疗的前提。基于细菌培养的药物敏感性试验（Drug Susceptibility Testing, DST）虽是检测耐药性的“金标准”，但耗时、技术要求高，且因儿童标本采集困难和检出率低而在临床实践中常不适用。GeneXpert?MTB/RIF（Cepheid, Sunnyvale, CA, USA）是结核病诊断的一项重大创新。它是一种半巢式实时聚合酶链式反应（PCR）检测，可同时鉴定MTB复合群DNA和与利福平（RIF）耐药相关的rpoB基因（Rv0664）突变，在大约2小时内提供结果。这种快速、集成的病原体和关键耐药标记检测方法，使其成为早期怀疑MDR/RR-TB的关键工具。世界卫生组织（WHO）已在2013年的政策更新中，正式推荐将GeneXpert MTB/RIF用于儿童人群的DR-TB（特别是RR-TB/MDR-TB）检测。然而，其在儿童人群中的敏感性和特异性仍需通过大规模研究进行验证。
尽管取得了这些进展，但在儿童DR-TB的早期临床风险分层方面仍存在巨大差距。列线图（Nomogram）作为一种可视化预测模型，能将多变量分析转化为实用的评分系统，为填补这一差距提供了潜在解决方案。它通过为临床医生提供直观的方法来估算患者特定的DR-TB概率，从而优化进一步诊断检测的资源分配并指导早期治疗决策。
在中国，儿童结核病的耐药特征呈现出明显的地区异质性。因此，系统分析儿童患者中DR-TB的流行病学特征，构建整合临床、影像和免疫学数据的多模态预测模型，评估GeneXpert MTB/RIF等新工具的诊断一致性，并探索T淋巴细胞亚群在DR-TB中的作用，对于改善儿童及青少年DR-TB的早期识别和指导治疗策略至关重要。
材料与方法
这是一项回顾性观察性队列研究。通过电子病历系统，回顾性纳入2018年7月1日至2023年12月31日期间在新乡医学院第一附属医院/河南省胸科医院住院、临床诊断为结核病的儿童患者（≤18岁）。根据预定义的纳入和排除标准筛选合格患者。收集并记录人口统计学和临床数据，包括年龄、性别、身高、体重、居住地、卡介苗（BCG）接种史、结核病暴露史、吸烟史、常规检查、人类免疫缺陷病毒（HIV）状态、疾病累及部位、涂片结果、MTB培养和DST结果、GeneXpert MTB/RIF结果、有效治疗前症状持续时间、治疗详情、影像学发现和淋巴细胞亚群谱。
所有胸部计算机断层扫描（CT）图像均由两名主治放射科医师独立盲审。就判读原则、病变特征和累及范围达成共识。若存在分歧，则参考高级放射科医师的意见确定最终诊断。
所有分枝杆菌和MTB培养结果均来自医院电子病历系统。对于分枝杆菌培养阳性的病例，进一步使用噻吩-2-羧酸酰肼和对硝基苯甲酸试验进行菌种鉴定。使用BACTEC MGIT 960系统进行MTB培养，随后进行DST。本研究收集了一线抗结核药物，包括异烟肼（Isoniazid, INH）、利福平（Rifampicin, RIF）、乙胺丁醇（Ethambutol, EMB）和链霉素（Streptomycin, STR）的DST结果。GeneXpert MTB/RIF于2022年引入我院，用于结核病诊断和利福平耐药性检测。
根据DST结果，将患者分为DS-TB组和DR-TB组。比较两组间的临床和影像学数据，以确定与DR-TB相关的风险因素，并据此开发预测模型。
结果
儿童结核病患者的一般特征和耐药谱
在研究期间，共审查了1876例临床诊断为结核病的儿童患者，其中223例符合纳入和排除标准（流程图）。所有患者出生时均接种过卡介苗，且HIV检测为阴性。研究队列包括112名男孩和111名女孩，男女比例约为1:1。患者年龄从2岁到18岁不等，中位年龄为16.0岁。青少年（13-18岁）占样本的78.5%。初治结核病例占90.13%（201/223），而复治结核病例占9.87%（22/223）。此外，87.89%的患者（196/223）诊断为肺结核（PTB），10.76%（24/223）诊断为PTB合并肺外结核（EPTB），1.35%（3/223）诊断为单独的EPTB。
根据DST结果，总体耐药率为26.5%（59/223），其中MDR-TB占所有DR-TB病例的50.8%（30/59）。各一线抗结核药物的耐药率如下：INH 22.4%（50/223），RIF 16.1%（36/223），STR 8.1%（18/223），EMB 3.6%（8/223）。在59例DST确认耐药的患儿中，耐药模式分布如下：单独INH耐药（n=18）；INH和RIF双重耐药（n=16）；INH、RIF、EMB和STR四重耐药（n=7）；INH、RIF和STR三重耐药（n=6）；单独RIF耐药（n=6）；单独STR耐药（n=3）；INH和STR双重耐药（n=2）；INH、RIF和EMB三重耐药（n=1）。
223例儿童患者中耐药结核病与药物敏感结核病的人口统计学和临床特征比较
DR-TB病例与DS-TB病例在治疗史、服药依从性、吸烟史、有效治疗前症状持续时间和感染部位方面观察到显著差异（所有P<0.05）。
220例儿童患者中耐药结核病与药物敏感结核病的影像学结果比较
排除3例孤立性EPTB病例后，留下220例儿童结核病例进行影像学分析——其中DS-TB 162例，DR-TB 58例。比较两组的胸部CT发现，DR-TB患者左下叶、右中叶和三个或更多肺叶受累的发生率显著高于DS-TB患者（P<0.05）。此外，DR-TB患者的胸部CT表现，包括树芽征、空洞形成、胸膜增厚以及纵隔淋巴结肿大或钙化，显著多于DS-TB患者（P<0.05）。
220例儿童患者中与耐药结核病相关的风险因素分析
以儿童DR-TB为因变量，以表1-3中具有统计学意义（所有P<0.05）的变量为自变量进行多因素逻辑回归分析。结果确定以下为儿童患者发生DR-TB的独立危险因素：复治史、吸烟史、右中叶受累和空洞形成（所有P<0.05）。
儿童耐药结核病列线图预测模型的构建与验证
基于多因素逻辑回归分析获得的显著因素，构建了一个列线图模型，用于定量预测儿童患者发生DR-TB的风险。该模型允许对每个患者进行个体化风险评估。例如，列线图总分为222分对应于发生DR-TB的预测概率为0.897。模型验证包括以下评估：（1）区分度——受试者工作特征（ROC）曲线分析显示，曲线下面积（AUC）为0.776（95%置信区间[CI]：0.710–0.841），表明模型具有良好的预测性能。（2）校准度——使用Bootstrap法（从原始数据集中重复抽样1000次）进行内部验证表明，校准曲线紧密跟随理想对角线，提示模型拟合可接受，预测结果与观察结果具有良好的一致性。（3）临床效用——决策曲线分析（DCA）显示，当阈值概率在8%至98%范围内时，该模型具有净临床获益，表明该列线图在临床环境中预测儿童DR-TB具有良好的实际应用价值。
56例儿童患者中耐药结核病与药物敏感结核病的T淋巴细胞亚群比较
在入组的结核病儿童患者中，有56例接受了T淋巴细胞亚群检测。所有入选患者均无已知的免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病或既往使用免疫抑制剂治疗史。其中12例诊断为DR-TB，44例诊断为DS-TB。两组基线特征平衡，任何T细胞亚群参数均未发现统计学显著差异（所有P>0.05）。
药物敏感性试验与GeneXpert MTB/RIF在检测利福平耐药性方面的一致性
在58例MGIT 960培养和GeneXpert MTB/RIF均为MTB阳性的儿童结核病例中，以MGIT 960系统获得的表型DST结果为参考标准。基于此标准，37例被归类为DS-TB，21例被归类为DR-TB。在DS-TB组（n=37）中，有2例使用GeneXpert MTB/RIF检测出RIF耐药相关基因突变，但在DST中对RIF敏感。在DR-TB组（n=21）中，16名患者使用GeneXpert MTB/RIF检测出RIF耐药，其中14例通过DST确认为RR-TB，2例未确认。在5例GeneXpert RIF阴性的DR-TB病例中，3例通过DST被归类为RIF敏感（2例仅对INH耐药，1例仅对STR耐药），2例在DST中检测为RR-TB阳性。
以DST为参考，GeneXpert MTB/RIF在检测RR-TB方面显示出87.50%（14/16）的敏感性和90.48%（38/42）的特异性。总共有6.90%（4/58）的病例被GeneXpert MTB/RIF识别为RR-TB，但未被DST识别。McNemar检验的P值为0.687，kappa系数为0.751（P<0.001），表明DST和GeneXpert MTB/RIF在检测RIF耐药性方面具有良好的一致性。
讨论
儿童和青少年结核病的一般特征和耐药模式
在我们的队列中，大多数结核病儿童患者年龄≥15岁，占病例的78.48%，这与之前的研究结果一致。本研究中的所有患者均接种过卡介苗，支持了先前来自印度的研究，该研究表明卡介苗的保护作用在12.5岁后会大幅下降。此外，年龄较大的青少年通常社交更广泛，暴露于结核病的风险更高，这可能也导致了这种年龄分布。值得注意的是，90.13%的患者为新发结核病例，而在DR-TB病例中，74.6%（44/59）为新诊断病例。这表明儿童患者中原发性DR-TB感染趋势明显，可能是由于成人耐药菌株的直接传播，突出了对儿童和青少年密切接触者进行严格筛查的必要性。此外，PTB是我们研究队列中结核病的主要形式，EPTB仅占病例的12.11%。这低于Li等人报告的24.6%以及世界卫生组织（WHO）在2022年报告的17%的全球估计值。这些差异可能归因于人口统计学、样本量或地理区域的差异。临床医生应警惕无症状或非典型形式的EPTB，以避免漏诊，这可能会增加DR-TB传播的风险。
在耐药特征方面，在中国，儿童和青少年结核病的耐药率仍然很高。在本研究中，总体DR-TB率为26.5%，其中MDR-TB占13.5%。这些数据与沈阳（DR-TB为28.78%，MDR-TB为12.90%）和四川成都（分别为24.3%和5.4%）的区域数据一致。然而，它们明显高于Song等人荟萃分析的结果，该分析报告DR-TB和MDR-TB率分别为13.59%和3.72%。这种差异凸显了中国DR-TB流行情况的严峻性和紧迫性，并强调了本研究的必要性，以及加强结核病控制和预防策略的迫切需求。我们的耐药谱显示，INH（22.4%）和RIF（16.1%）的耐药率最高，这与国内和国际报告的耐药模式一致，尽管本研究中观察到的水平明显更高。这可能归因于这两种一线抗结核药物在治疗活动性结核病以及作为包括儿童和青少年在内的密切接触者的预防性治疗中的广泛使用。虽然Song等人报告STR耐药最为普遍（10.82%），但在我们的研究中其耐药率相对较低。这种差异可能是由于实施了基于WHO指南的标准化治疗方案和区域处方控制措施，表明了精准防控策略的有效性。此外，由于转向二线治疗而减少使用STR，可能间接抑制了该药耐药性的发展。
药物敏感结核病与耐药结核病的临床和影像学特征比较
先前关于DR-TB风险因素的研究由于种族、人群特征、地理区域和研究设计的差异而显示出相当大的变异性。在本研究中，多因素逻辑回归分析确定复治史、吸烟史、右中叶受累和空洞形成是儿童和青少年DR-TB的独立危险因素。
与DS-TB相比，DR-TB患者的复治频率显著更高（比值比[OR] = 5.303, 95% CI: 1.378–20.414, P=0.015）。这可能与治疗时间长、服药依从性不规律、治疗不完整或复治病例初始药物敏感性谱不完整有关。所有这些都有助于MTB中耐药相关基因突变的发展，从而促进DR-TB在既往治疗过的患者中传播，并增加治疗难度和传播风险。这些发现与Sun等人和Li等人报告的结果一致。
吸烟会引入有害物质，增加氧化应激和炎症，损害支气管黏膜屏障并削弱免疫反应，从而增加对结核感染的易感性。在本研究中，发现吸烟对DR-TB有显著影响（OR = 4.129, 95% CI: 1.233–13.825, P=0.021），表明吸烟可能增加感染DR-TB菌株的风险。潜在的机制包括吸烟引起的药物吸收受损、药代动力学改变、免疫抑制和较差的治疗依从性。此外，吸烟可能会干扰培养阴转并延长治疗时间，从而促进DR-TB菌株的出现和持续存在。这些发现与Tao的报道一致，强化了戒烟是预防结核病，特别是DR-TB的关键措施这一结论。
本研究通过对胸部CT影像的分析，揭示了DR-TB与DS-TB在病变分布和特征上的显著差异。数据显示，DR-TB组中多肺叶（≥3叶）受累病例的比例显著高于DS-TB组（P<0.05）。这一发现与Cheng等人关于弥漫性肺部受累的结论一致，也与先前描述DR-TB病变多叶分布模式的研究相符。然而，在多变量分析中，两组之间未观察到显著差异，这可能归因于样本量限制或混杂因素的影响。值得注意的是，本研究发现右中叶（P=0.001）和左下叶（P=0.015）的病变更常见于DR-TB。多因素分析进一步确定右中叶受累是一个独立的危险因素（OR = 3.004, 95% CI: 1.148–7.863, P=0.025）。这一结果与大多数先前的研究不同，可能是由于年龄分层、病变分类标准或流行MTB菌株的区域差异造成的。这些发现强调了需要通过多中心研究进一步验证。
在本研究中，空洞形成被证实是DR-TB的独立危险因素。DR-TB组的空洞发生率显著高于DS-TB组（74.1% vs 51.2%，P=0.002）。多因素分析进一步表明，空洞形成更常见于DR-TB（OR = 2.950, 95% CI: 1.325–6.567, P=0.008），这与先前研究的结果一致。这一观察结果得到了分子生物学机制的有力支持。空洞壁的纤维沉积和血管稀疏阻碍了药物渗透，并创造了有利于持续感染的微环境，促进了耐药突变菌株的选择和扩增。特别是基质金属蛋白酶（MMPs），尤其是MMP-9的过表达，通过降解细胞外基质加速空洞形成。此外，先前的研究报告称，儿童DR-PTB的胸部CT图像通常显示多发的、多叶的、厚壁空洞，而薄壁空洞更常见于DS-TB。这表明与空洞特征相关的定量指标可能作为评估耐药风险的关键参数。这些发现为深入分析空洞特征和分子水平研究提供了新的视角。
使用ROC曲线分析评估了预测模型的区分性能。结果表明，复治史、吸烟史、右中叶受累和空洞形成对DR-TB风险评分有显著贡献，AUC为0.776（95% CI：0.710–0.841）。这表明该模型可以有效区分DR-TB和DS-TB病例。使用校准曲线进一步评估了模型校准，显示拟合曲线与理想对角线紧密对齐，表明预测风险和观察风险概率之间具有良好的一致性。通过DCA评估了模型的临床效用，表明当阈值概率在8%到98%之间时，该模型提供了正的净获益，证明了其在指导临床决策方面的潜在价值。虽然AUC和校准曲线分别评估了模型的区分能力和校准精度，但DCA曲线直接反映了其临床效用。通过整合这三种验证方法，本研究全面验证了列线图预测模型的科学稳健性和实际效用。需要注意的是，本研究进行的验证是内部的，使用Bootstrap法对原始数据集进行重采样。尽管这提供了模型性能的估计并有助于减轻过拟合，但在推荐广泛的临床应用之前，必须在独立的、来自不同地理或临床环境的前瞻性儿童队列中进行外部验证，以验证我们列线图的普适性和稳健性。
T淋巴细胞亚群的比较
作为总T淋巴细胞的标志物，CD3+T细胞在细胞免疫激活中起着核心作用。此外，CD4+T细胞在抗原刺激下分泌细胞因子，激活巨噬细胞杀死MTB，而CD8+T细胞通过清除失活靶细胞和诱导凋亡发挥细胞毒性作用。它们还以协同方式增强吞噬功能，有助于形成特异的抗结核免疫反应。CD4+和CD8+T细胞之间的平衡对于介导保护性免疫至关重要。我们之前的研究表明，结核感染儿童的细胞免疫防御功能受损，在重症病例中观察到的缺陷更为明显。在本研究中，我们进一步调查了DR-TB患者与DS-TB患者在T淋巴细胞亚群方面的差异。结果显示，DR-TB组的T细胞亚群水平略高于DS-TB组；然而，差异缺乏统计学显著性（所有P>0.05）。这一发现与几项成人人群研究不同，这些研究报告了与DR-TB相关的T细胞亚群（如CD4+、CD8+计数或CD4/CD8比值）的显著改变，考虑了几种可能的解释：（1）样本量小，可能引入了统计偏差；（2）DS-TB组中复治病例比例较高，长期治疗可能导致T细胞耗竭增加；（3）免疫成熟度差异，因为大多数先前研究是在成人中进行的，而儿童和青少年的免疫系统仍在发育中，使得T细胞亚群更容易受到混杂因素的影响；（4）耐药机制的复杂性，可能主要不涉及免疫失调。鉴于本研究的回顾性设计和局限性，需要进一步进行样本量更大的前瞻性、多中心研究来验证这些发现。
药物敏感性试验与GeneXpert MTB/RIF在检测利福平耐药性方面的一致性
当前的临床指南建议使用MDR-TB特异性治疗方案管理MDR-TB或RR-TB患者。GeneXpert MTB/RIF是一种基于分子信标技术的半巢式PCR检测方法，能够快速检测MTB及其对RIF的耐药性。自2013年世界卫生组织（WHO）推荐其用于辅助诊断儿童和青少年疑似PTB、MDR-TB、TB-HIV共感染和结核性脑膜炎以来，GeneXpert MTB/RIF已成为识别RR-TB越来越重要的工具。
在本研究中，以DST为金标准，评估了GeneXpert MTB/RIF对儿童RR-TB的诊断一致性。结果显示灵敏度为87.50%，特异度为90.48%，kappa系数为0.751，表明两种方法在检测RIF耐药性方面具有良好的一致性。这些来自中国明确定义的儿童队列的性能指标，与其他儿童和成人研究报告的高灵敏度和特异性一致，为高结核病负担地区环境提供了有价值的、当代的特定证据。值得注意的是，有4例（6.90%）RR-TB病例仅由GeneXpert MTB/RIF识别，证明了其在早期检测中的补充价值。这些发现得到了Lavu等人和Sun等人进行的研究的支持。
局限性
本研究有几个局限性。首先，儿童患者的培养阳性率低可能引入了选择偏倚，可能低估了幼儿中DR-TB的负担。相比之下，临床和影像学特征可能更接近成人的较大儿童被过度代表。其次，未评估二线抗结核药物的耐药性。第三，考虑到T淋巴细胞亚群分析仅限于有可用检测结果的病例，疾病分期差异、样本量小以及缺乏治疗后比较，这项回顾性研究可能无法准确反映DS-TB与DR-TB之间的真实免疫状态。第四，预测列线图模型使用Bootstrap重采样进行了内部验证，但尚未在独立的儿童队列中进行外部验证。虽然内部验证减轻了过拟合并提供了性能估计，但在推荐临床使用之前，必须进行外部验证以确认模型在不同环境中的普适性和稳健性。第五，GeneXpert MTB/RIF仅在过去2年内引入我们中心，导致纳入病例数少，并且在检测RIF耐药性方面DST与GeneXpert MTB/RIF的一致性分析可能存在偏倚。第六，由于此类病例数量有限，且同时具有GeneXpert阳性和DST阳性结果的子集更小，无法可靠评估GeneXpert MTB/RIF在EPTB中的诊断性能。这阻碍了对其在儿童EPTB标本中敏感性和特异性的有意义的结论，而这些标本通常菌量少，对核酸扩增检测构成已知挑战。第七，我们的诊断评估仅限于临床实践中常规收集的标本（如痰液、BALF、胸腔积液）。未系统地收集或分析非侵入性样本，例如可用于新型免疫学检测的尿液。尽管这些方法代表了未来儿童友好型诊断的有前途的方向，但它们超出了对既定临床和实验室工具进行回顾性评估的范围。
结论
总之，儿童和青少年结核病主要影响年龄较大的个体，且以新发病例为主。本研究开发的列线图模型能有效预测儿童患者发生DR-TB的风险，AUC为0.776。关键预测因素包括复治史、吸烟史、右中叶受累和空洞形成。GeneXpert MTB/RIF检测在检测RIF耐药性方面表现出87.5%的灵敏度，并且与DST具有良好的一致性，支持其作为儿童患者DR-TB早期筛查工具的作用。在DR-TB病例中未观察到T淋巴细胞亚群的显著变化，这与成人研究结果形成对比，强调了需要更大样本量进行进一步验证的必要性。
