PFSSTKT（PFS）-功能化的分层多孔细胞外基质支架通过招募内源性干细胞并诱导软骨生成来促进关节软骨再生

《Acta Biomaterialia》：PFSSTKT(PFS)-functionalized Hierarchical Porous ECM Scaffolds Facilitate Articular Cartilage Regeneration through the Recruitment of Endogenous Stem Cells and Chondrogenic Induction

软骨自体修复促进策略研究。采用低温沉积制造技术制备多孔ECM支架，修饰骨 marrow 趋化肽PFS，通过体外细胞实验和兔全层软骨缺损模型验证，证实PFS-ECM支架能显著提升内源性干细胞招募效率，促进透明软骨样组织再生，改善材料力学性能与组织学评分。

　　

陈明雪|吴江|王浩|杨永康|隋翔|傅立伟|郭全义

中国北京首都医科大学北京积水潭医院骨科手术科

摘要

关节软骨损伤仍然是一个主要的临床挑战，因为其自我修复能力有限。目前的基于细胞的疗法受到诸如细胞去分化以及调控障碍等问题的限制，而现有的支架系统往往缺乏有效组织再生所需的必要生化信号。因此，需要一种仿生无细胞策略，既能招募内源性干细胞，又能建立有利于其向软骨细胞分化的生化微环境。在这项研究中，我们开发了一种通过低温沉积制造（LDM）工艺制备的生物活性、多层次多孔细胞外基质（ECM）支架，并用骨髓定向肽PFS（氨基酸序列PFSSTKT）对其进行功能化处理，以促进原位软骨再生。该支架保留了ECM的天然生化特性，同时能够稳定地与趋化肽PFS结合。体外研究表明，PFS功能化的ECM支架表现出良好的生物相容性，并支持细胞黏附、迁移和增殖。使用兔全层软骨缺损模型的体内实验进一步显示，与ECM组和对照组相比，PFS-ECM组的内源性干细胞招募和类透明软骨再生效果更显著。再生组织在基质组成、生物力学性能和组织学评分方面均有改善。总体而言，这项工作提出了一种无细胞、生物功能化的ECM基支架策略，能够促进关节软骨的内源性修复，为无需外源性细胞移植的软骨再生提供了一种有前景的方法。

意义声明

关节软骨修复仍然是一个重要的临床挑战。虽然当前的基于细胞的疗法存在诸如细胞去分化等局限性，但传统支架往往缺乏必要的生物诱导信号。为了解决这一挑战，我们开发了一种用趋化肽PFS功能化的生物活性细胞外基质支架。在这种设计中，PFS肽增强了内源性干细胞的招募，而ECM则提供了软骨形成的微环境。实验结果证实，这种支架显著促进了干细胞的迁移和软骨分化。动物实验表明，PFS-ECM组在细胞招募、透明软骨再生和机械性能方面优于对照组，为临床软骨修复提供了一种有前景的无细胞解决方案。

引言

关节软骨损伤在骨科中非常普遍，如果不进行有效干预，通常会导致进行性退化，最终发展为骨关节炎^1,2。由于软骨的缺血特性和低细胞密度，其内在的再生能力有限，这使得软骨缺损的修复成为一个持续的临床难题³。微骨折（MF）因其成本效益和微创性而成为最常用的首选治疗方法^4,5。然而，微骨折的长期效果并不令人满意，尤其是在老年患者中，因为修复组织主要是纤维软骨，缺乏天然透明软骨的生化及生物力学特性，无法承受持续的机械负荷^6,7。微骨折后效果不佳的主要原因是内源性干细胞/前体细胞（ESPCs）的动员不足，以及缺乏引导软骨再生的组织特异性微环境^{[8], [9], [10]}。

为了解决这些局限性，基于生物材料的支架在软骨再生中的应用得到了广泛研究¹¹。聚乳酸（PLA）¹²、聚（ε-己内酯）（PCL）¹³、明胶、透明质酸（HA）¹⁴和甲基丙烯酰明胶（GelMA）等聚合物显示出良好的生物相容性和可调的机械性能¹⁵。然而，这些合成或半合成材料无法再现天然软骨细胞外基质（ECM）复杂的生化微环境¹⁶。去细胞化的软骨ECM富含组织特异性生化信号，作为一种有前景的支架材料，能够更好地模拟天然软骨的组成和功能。为了提高ECM的可加工性¹⁷，我们之前开发了将ECM与水性聚氨酯（WPU）结合的混合墨水，并通过低温沉积制造（LDM）技术制备了多孔支架，该技术能够保留天然生物材料的生物活性¹⁸。在此基础上，我们最近成功制备了一种可打印的纯ECM生物墨水，并报告称7%的ECM浓度为细胞增殖和软骨分化提供了最佳支持，为基于支架的软骨再生奠定了一个有前景的平台¹⁹。

尽管如此，软骨损伤后内源性干细胞的招募仍然不足以实现有效再生^20,21。虽然已经探索了外源性间充质干细胞（MSCs）移植，但这种方法存在多种局限性，包括细胞处理复杂、成本高、移植效率低以及监管障碍²²。因此，利用体内固有的修复能力，通过招募和引导内源性干细胞的无细胞策略受到了越来越多的关注。在各种趋化剂中，骨髓定向肽PFSSTKT（氨基酸序列PFS）在促进内源性干细胞向损伤部位迁移方面显示出强大的潜力^23,24。

在这项研究中，我们设计了一种通过LDM工艺制备的多层次多孔ECM支架，并使用点击化学方法（Figure 1）对其进行PFS功能化处理。我们假设这种支架通过同时提供趋化信号和模拟软骨的微环境，能够协同增强内源性干细胞的招募和软骨分化。我们系统地评估了该支架的体外生物活性，并在兔全层软骨缺损模型中评估了其再生潜力。本研究旨在提供一个强大的无细胞平台，用于原位关节软骨再生，并为临床软骨修复提供转化策略。

章节片段

ECM的制备

ECM的制备采用了之前描述的改进方案^{11,25, 26}。猪关节软骨样本经过10次冻融循环（-80°C至室温），然后进行机械粉碎。将匀浆组织在trypsin-EDTA中孵育24小时。组织用PBS（pH 7.4）冲洗后，使用核酸酶溶液（50 U/mL DNase I，1 U/mL RNase A）在37°C下进行3小时的酶法去细胞化处理。

ECM的制备和表征

我们采用改进的方法制备了ECM。通过组织学染色（Safranin O、甲苯胺蓝和II型胶原IHC染色）和生化表征，在去细胞化前后分析了软骨的组成。这些分析表明，天然软骨组织富含胶原和糖胺聚糖（GAGs）（Figure S1A，支持信息）。DAPI染色（Figure S1B，支持信息）证实了去细胞化的成功。

讨论

先前的研究已经证实关节腔内存在大量的MSCs，包括来自滑膜、滑液、髌下脂肪垫和骨髓的MSCs^28,29。在关节软骨损伤后，这些MSCs可以在特定的生化信号作用下被激活并招募到损伤部位，参与内源性修复过程^11,30。然而，由于缺乏再生微环境和持续的趋化信号，这种内在的修复能力受到限制

结论

在这项研究中，我们开发了一种基于生物活性细胞外基质的支架，该支架采用低温沉积打印技术制备，并用趋化肽PFS进行功能化处理。该支架结合了ECM来源的信号和靶向内源性干细胞的招募，从而实现了无细胞方式的软骨再生。这些发现表明，具有趋化信号功能的ECM支架是内源性软骨修复的一种有前景的方法。

贡献

陈明雪：撰写原始稿件、概念构思、资金获取。 吴江：撰写原始稿件、概念构思。 王浩：数据管理。 杨永康：实验研究、软件使用、资料收集。 隋翔：方法学设计。 傅立伟：撰写、审稿与编辑、实验研究。 郭全义：撰写、审稿与编辑、资金获取。

CRediT作者贡献声明

陈明雪：撰写 – 审稿与编辑、撰写原始稿件、资源获取、概念构思。 吴江：撰写原始稿件、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构思。 王浩：方法学设计、数据管理、概念构思。 杨永康：软件使用、方法学设计、实验研究。 隋翔：项目监督、项目管理、实验研究。 傅立伟：撰写 – 审稿与编辑、撰写原始稿件、验证、项目监督。 郭全义：