青光眼是一种进行性的视神经病变，是全球导致不可逆失明的主要原因之一。在原发性开角型青光眼（POAG）中，由于房水流出阻力增加而引起的眼内压（IOP）升高是该疾病的关键风险因素[[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]]。在正常的液体流出路径中，小梁网（TM）、管周组织（JCT）和施莱姆管（SC）的内皮细胞对房水流出提供生理性的阻力[7,[13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22]]，但在POAG患者中这种阻力异常升高，显著促进了眼内压的升高[19,23]。房水通过小梁网的流动是分段进行的，存在明显的高流量（HF）、中等流量（IF）和低流量（LF）区域[15,19,[24], [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32], [33], [34], [35], [36], [37]]。我们在3名正常人供体中的定量灌注成像显示，总流量的62%通过高流量区域流出，22%通过中等流量区域流出，仅16%通过低流量区域流出[38]。相比之下，在青光眼患者中（3名供体），低流量区域占比上升至49%，中等流量区域占比降至30%，高流量区域显著减少（21%）[23,[38], [39], [40]]。
这种分布变化的重要性：我们的机械拉伸测试表明，正常人眼中的低流量区域硬度是高流量区域的2.5倍，在青光眼患者中则高达5.8倍；平均而言，低流量区域的硬度约为高流量区域的4.1倍[41]。我们最近使用的创新压力控制光学相干断层扫描（OCT）技术也证实，高流量区域比低流量区域更具柔韧性/顺应性[41,42]。大部分房水流出阻力发生在坚硬的低流量区域，因此这一区域很可能提供了更大的总流出阻力[19]。路径中的这些区域差异表明，低流量区域的细胞可能经历了不同的机械微环境，并可能产生不同的生物学反应。这种细胞-细胞外基质（ECM）相互作用的局部改变可能解释了为什么某些流出路径区域更容易出现阻力增加和组织变化，从而与青光眼相关[32]。
除了由于眼内压波动导致的小梁网/JCT/SC复合体所承受的机械应变[43]外，小梁网还受到房水流出的流体剪切力的影响。当房水流经小梁网（剪切力较高的区域）和施莱姆管内壁（剪切力较低的区域）时，会在细胞上产生剪切力[44,45]。小梁网/JCT细胞通过整合素感知与眼内压相关的负荷，从而重塑细胞骨架并改变蛋白质表达和磷酸化，以精细调节流出阻力[35,44,[46], [47], [48], [49], [50], [51], [52], [53], [54], [55], [56], [57], [58]]。细胞外基质的硬度反过来又控制着细胞的存活甚至细胞命运[[59], [60], [61]]。小梁网/JCT细胞会调整自身的硬度以匹配周围细胞外基质的硬度[[61], [62], [63]]。在正常眼中，这种相互作用有助于适应压力变化，保持眼内压的稳定[7,[63], [64], [65]]。然而，在青光眼中，细胞和它们的细胞外基质都会变硬[19]，适应性也随之丧失[66]。原子力显微镜（AFM）测量结果证实，青光眼患者的低流量区域细胞比高流量区域细胞更硬[19,23,35,63,67,68]。我们最近的研究[40]显示，在1.5 kPa（无流动时：0.56 Pa vs. 有流动时：1.13 Pa）和21.7 kPa（无流动时：12.70 Pa vs. 有流动时：15.70 Pa）的聚丙烯酰胺（PAM）凝胶上，正常的小梁网/JCT细胞在有流动条件下表现出更大的牵引力。然而，青光眼患者的小梁网/JCT细胞在较软的1.5 kPa基质上牵引力仅增加了2.75倍（无流动时：3.43 Pa vs. 有流动时：9.45 Pa），而在较硬的21.7 kPa基质上则变化不大（无流动时：20.25 Pa vs. 有流动时：19.54 Pa）。我们推测，由于低流量区域几乎不受剪切力的影响，而中等流量区域仍会感受到一定程度的剪切力，因此这些区域仍能对剪切力作出反应并得以维持。随着剪切力感知能力的减弱（尤其是在低流量细胞中），机械转导能力下降，细胞和细胞外基质变硬，形成一个正面的细胞-基质反馈循环，促使它们向低流量区域转变[38], [39], [40],69]。我们的最新研究[40]间接表明，剪切力感知能力的丧失可能导致细胞硬化，使原本较为柔韧的中等流量区域转变为坚硬的低流量区域。
越来越多的研究表明，剪切应力会触发流出路径中的生化反应，有助于调节眼内压。有证据表明，小梁网细胞具有机械敏感性信号通路（如伸展激活的离子通道），这些通路将流体力量与细胞行为的变化联系起来[45,70]。Zode团队[70]和Krizaj团队[45]的最新重要研究指出，小梁网细胞中的Piezo1通道可作为剪切应力的传感器；激活Piezo1通道可以增强流出能力并维持压力稳态，这与剪切力转导的保护作用一致。同时，TRPV4-eNOS信号通路将机械信号与一氧化氮（NO）的产生联系起来；在青光眼中，这一通路的损伤会升高眼内压。这些发现促使人们直接研究剪切力与细胞力学之间的耦合[45,70]。尽管有这些认识，但流体剪切力与小梁网细胞产生的牵引力之间的耦合关系尚未被直接量化。
牵引力显微镜（TFM）[38], [39], [40],69]用于可视化细胞对其细胞外基质（ECM）的力传递过程。我们将0.2微米的荧光微球嵌入I型胶原蛋白凝胶[38,71]或涂有胶原蛋白的聚丙烯酰胺凝胶[39,40]中，并使用配备温育器的旋转盘共聚焦显微镜获取体积共聚焦图像。这些细胞机械转导特征为宏观层面的房水模型提供了定量依据。
为填补上述知识空白，本研究探讨了剪切流（模拟房水在小梁网细胞上的流动）对高流量和低流量小梁网/JCT细胞剪切感知机制的影响。我们开发了一个实验系统，能够在生理相关的流体动力学环境中捕捉小梁网/JCT细胞对流动扰动的时序响应。从高流量和低流量区域分离出的正常人小梁网/JCT细胞被培养在涂有I型胶原蛋白的软质聚丙烯酰胺（PAM）水凝胶上（弹性模量约为4.7 kPa），这种基质硬度旨在模拟天然小梁组织的柔韧性，以接近体内机械条件。荧光微球或FluoSpheres被嵌入PAM凝胶中，从而实现三维TFM分析，以绘制细胞在所有三个维度上的牵引应力。我们在细胞表面引入了50–60 μL/分钟的受控灌注。CFD分析表明，这种灌注方式在中心分析区域内产生了空间均匀的极低剪切应力（WSS约为10?? Pa）。选择这种温和的灌注刺激是为了实现长时间稳定的活体成像和牵引力重建，应将其视为剪切扰动的下限，而不是施莱姆管腔内剪切力的直接复制。我们测试了两种互补的流动情景，以观察剪切力的起始和消除对细胞的影响。在情景1中，细胞首先在无剪切力状态下保持6小时，然后经历6小时的流动；在情景2中，细胞首先在流动状态下保持6小时，随后在无剪切力状态下保持6小时。在整个实验过程中，使用时间延迟共聚焦成像技术追踪荧光微球在PAM凝胶基质中的位移，从而计算出高时间分辨率下的牵引力场。通过比较流动状态和无流动状态下的牵引力大小、散度和旋度，以及高流量和低流量来源的细胞培养物之间的差异，我们能够了解剪切力如何急性调节小梁网/JCT细胞-基质的机械相互作用。
