《Advanced Drug Delivery Reviews》：Microfluidics for separation, detection, and engineering of extracellular vesicles
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微流控技术通过精准操控改善外泌体分离、检测与工程，推动精准医疗发展，但仍面临规模化与标准化挑战。
Lamia A. Heikal|Sherif I. Hamdallah|Salma E. El-Habashy|Asmaa A. Ashour|Riham M. El-Moslemany|Amal H. El-Kamel
埃及亚历山大大学药学院药学系
摘要
本文详细探讨了微流控技术如何重塑细胞外囊泡（EV）研究领域，将技术创新与临床应用紧密联系起来。文章阐述了微流控的基本原理（如层流和纳米级操控）及其在提升EV分离、检测和工程化方面的实际应用，不仅展示了这些系统的运作机制，还强调了它们对诊断、治疗和精准医学的重要性。文中介绍了多种分离策略，包括免疫亲和捕获、基于大小的纳米过滤、声学分离和介电泳技术，并以ExoChip、Exodisc和Nano-IMEX等设备为例进行说明。与传统超速离心法相比，这些方法能够实现更高的回收率、纯度和通量，同时所需样本量更少，处理时间也更短。此外，文章还介绍了将微流控技术与先进生物传感技术相结合的检测工具，如电化学和阻抗平台以及表面等离子体共振和表面增强拉曼散射等光学技术。这些方法使得能够在单囊泡水平上进行灵敏、无标记和实时的EV分析，提供精确的电学和分子特征。此外，文章还评估了微流控技术在将治疗性物质装载到EV中的应用，指出其相比传统方法具有更高的精度、效率和可扩展性。同时，文章还描述了用于EV表面修饰的微流控策略以及集成细胞培养、EV生产、捕获、装载和可控释放的生物反应器平台。值得注意的是，文章还分析了设备规模化面临的挑战，并讨论了从人工智能驱动的信号解读到标准化、可扩展制造等未来发展方向，这些都有助于推动微流控技术在现实临床中的广泛应用。
引言
细胞外囊泡（EV）是由几乎所有细胞类型分泌的膜结合结构，在多种体液中大量存在，是细胞间通信的关键介质。根据2023年MISEV指南，EV可分为三大主要亚型：外泌体（直径30至150纳米），在内体腔室内形成后通过多囊泡体与质膜融合释放；微囊泡（通常100–1000纳米），通过质膜的直接出芽和分裂形成；第三类是凋亡小体（500至5000纳米），在细胞凋亡晚期产生，含有细胞碎片、细胞器片段和核物质[1]。EV通过多种机制参与复杂的细胞间通信：它们可以在细胞表面直接与受体结合，即时调节信号通路；或者与受体细胞融合，将其携带的生物活性物质（如蛋白质、脂质和核酸）直接输送到细胞质中，从而影响基因表达和细胞行为。EV还通过多种内吞途径被摄取，包括网格蛋白依赖性、caveolin介导、脂质筏相关和微胞饮途径，每种途径受EV亚型、表面分子和组成的影响[2]。EV的摄取效率和性质受多种因素影响，包括EV类型和分子 cargo、受体细胞的生理状态和受体谱型以及微环境因素（如细胞外基质特性、pH值和温度）。通过这些综合通信方式，EV能够在短距离和长距离内传递分子信号，对组织稳态、免疫反应和病理过程产生广泛调控作用[2]。
EV是多种细胞物质的丰富载体，其 cargo反映了母细胞的身份及其生理和病理状态。EV通常包含细胞表面四跨膜蛋白（如CD9、CD63和CD81）以及一系列受体、酶和信号分子，这些成分反映了细胞类型及其当前状态。EV还携带特定疾病的生物标志物，如神经退行性疾病中的TDP-43和tau蛋白或癌症中的ORM1，从而将EV cargo与病理情况联系起来[3]。此外，鞘脂、胆固醇、鞘磷脂和磷脂酰丝氨酸等脂质不仅有助于维持EV膜的结构完整性，还在囊泡生物发生和靶向细胞信号传导中起关键作用。核酸（包括miRNA、mRNA、lncRNA和来自基因组及线粒体的DNA片段）也常被选择性地装载到EV中，这些特征有助于其在诊断和预后中的应用。EV还运输其他生物分子，如细胞因子、生长因子和代谢物，甚至病原体分子（如病毒RNA和蛋白质），从而调节受体细胞行为、影响免疫反应并促进病理信号的传播。综上所述，EV作为细胞间通信的动态介质，在生物标志物发现和治疗开发中具有重要作用[3]。
由于EV的稳定性、在体液中的易获取性以及其封装疾病特异性分子标记物的能力，它们在临床中具有重要意义。因此，EV成为强大的液体活检工具，有助于多种情境下的非侵入性诊断[4]。例如，EV中的CD63、vimentin和CD81蛋白以及与疾病相关的核酸可作为检测和预测癌症（包括结直肠癌[5]和前列腺癌[6]）的可靠生物标志物。在传染病中，循环EV中存在的病毒包膜蛋白和宿主-病原体特异性miRNA能够高度敏感地早期检测HIV、EBV、HBV、HPV和SARS-CoV-2等病原体[7]、[8]。在中枢神经系统疾病中，富含神经元蛋白（如HMGB1和神经丝轻链NFL）的EV以及脑脊液或血浆中的相关RNA为监测神经炎症和神经退行性疾病提供了重要工具[9]。在治疗方面，EV通过独特的靶向能力和生物相容性正在改变药物递送和再生医学：工程化EV能够穿越生物屏障（如血脑屏障和黏膜层），递送CRISPR/Cas9基因编辑工具和酶等治疗性物质，推动精准医学和疾病矫正的发展[10]。此外，肿瘤细胞和树突状细胞衍生的EV被用于免疫调节和个性化癌症疫苗策略[11]，而间充质干细胞（MSC）衍生的EV则支持组织再生、血管生成和免疫反应调节，有利于伤口愈合、神经保护和心脏修复[13]。最新证据表明，凋亡小体作为抗炎载体和治疗剂的靶向载体在组织再生和免疫调节方面具有多重临床潜力[14]。
尽管EV作为诊断和治疗工具具有显著临床潜力，但由于缺乏高效、标准化的分离、检测和功能工程方法，其临床应用仍受到限制。传统的分离、检测和工程方法与EV的复杂性和治疗需求存在根本性不匹配[15]、[16]、[17]。这些限制凸显了迫切需要创新解决方案，以解决EV分离、检测和工程中的可扩展性、纯度和重现性问题[17]。
微流控平台通过利用可预测的层流和主导的微尺度力，实现对粒子传输和分离的精确、可重复控制，从而在EV分离方面具有明显优势。与传统批量分离方法相比，微流控系统可以从少量样本中快速、可重复地分离EV，同时减少试剂消耗，并通过温和、低剪切处理保持囊泡完整性[18]、[19]。其微型化架构支持自动化、高通量工作流程和多重分离策略，最小化污染和实验变异性。在封闭的微流控设备中整合基于大小、电荷和亲和力的分离机制，进一步实现了特定EV亚群的选择性富集，提高了分离特异性和分析灵敏度[20]、[21]。
EV在大小、生物发生和分子组成上的异质性给其临床应用带来了挑战。微流控技术通过物理力（如声学、电学或流体动力学）或基于分子亲和力的方法直接解决了这一问题，能够实现精确、高通量和选择性的EV分离和表征，根据大小、密度或表面标记物区分囊泡[21]。重要的是，单EV（SiEV）微流控平台允许对单个囊泡进行检测，揭示在批量分析中被掩盖的分子和功能异质性[22]。与液滴微流控、等离子体传感和纳米流式细胞术的结合进一步提高了灵敏度和分辨率，加速了EV研究向精准诊断和个性化医学的转化[23]。
除了分离外，微流控方法还通过实现精确、连续和可扩展的负载过程来推进基于EV的治疗，同时保持囊泡完整性。芯片上的策略（如被动混合、声学辅助超声处理、流式电穿孔和机械纳米穿孔）提供了可调、高效且低试剂消耗的负载方式。集成的微流控生物反应器通过将生产、纯化、装载和表面功能化结合在统一的自动化系统中，进一步简化了EV治疗制造流程[24]。
本文总结了微流控技术在EV分离、检测和工程方面的最新进展，批判性地评估了其与传统方法的优缺点。文章强调了集成“多功能”微流控平台的优势，这些平台将多种功能整合在一个系统中，从而加速了基于EV的治疗和诊断向临床应用的转化。最后，文章讨论了关键挑战和未来发展方向，为开发可扩展、标准化和临床相关的微流控解决方案提供了框架。
细胞外囊泡的分离技术
高效的EV分离对于其准确表征和临床应用至关重要，但由于其纳米级大小、异质性和生物基质的复杂性，技术上仍面临挑战。常用的分离方法包括差速超速离心、密度梯度分离、尺寸排阻色谱和基于聚合物的沉淀，但这些方法往往在纯度、产量、处理时间和可扩展性之间难以平衡
细胞外囊泡的检测技术
由于EV在细胞间通信中的关键作用及其作为微创生物标志物的潜力，其检测技术受到了广泛的科学和临床关注[60]。多种与EV相关的成分（如细胞因子、DNA和RNA）已被探索作为潜在的生物标志物[61]。这些分子 cargo使EV在多种疾病（如癌症[63]、神经退行性疾病[64]）的诊断和预后应用中具有高价值
EV的工程化策略
除了高效分离、检测和分析外，微流控技术还支持EV的精确、高通量工程化，包括可控的生成、修饰和负载。关键特性包括确定的层流和流体动力学聚焦，以实现精确的尺寸控制和快速高效的流动混合与装载。此外，还具备可调的剪切力和停留时间，以保持膜完整性。同时，这些技术还减少了试剂消耗
挑战与未来展望
微流控技术通过实现纳米级颗粒的高精度操控，改变了EV的分离方式，但将其应用于临床和制造仍受到生物学和工程学挑战的制约。从生物学角度来看，EV在大小、密度和分子组成上的显著异质性与非囊泡实体（如脂蛋白和蛋白质聚集体）存在重叠，这增加了分离的复杂性
结论
微流控技术在EV的分离、检测和工程方面展现了巨大潜力，提供了创新方法（如免疫亲和捕获、基于大小的过滤以及介电泳和声流控等技术）。这些平台通常提高了产量、纯度和重现性，同时减少了样本和试剂的需求。然而，大多数微流控设备仍处于研究和开发阶段
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
